【儀器科普】液相色譜儀（HPLC）的基礎(chǔ)原理及系統(tǒng)組成

一、基礎(chǔ)原理

液相色譜儀（HPLC）基于溶質(zhì)在固定相和流動相之間的分配差異實現(xiàn)分離，其核心原理可概括為：

1. 分配差異：樣品溶解于流動相（液體）后，隨流動相進(jìn)入色譜柱（固定相）。不同溶質(zhì)因與固定相的相互作用（如吸附、分配、排阻、親和等）強(qiáng)度不同，在固定相中滯留時間不同，從而按順序流出色譜柱。
2. 分離過程：以三組分樣品（A、B、C）為例，分配系數(shù)小的組分（如A）不易被固定相保留，最先流出；分配系數(shù)大的組分（如C）滯留時間長，最后流出；B的分配系數(shù)介于兩者之間，中間流出。通過這一過程，混合物中的各組分得以分離。
3. 熱力學(xué)與動力學(xué)綜合作用：分離效果取決于溶質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)差異（熱力學(xué)因素），以及擴(kuò)散系數(shù)、固定相粒度、柱填充情況、流動相流速等（動力學(xué)因素）。

二、系統(tǒng)組成

HPLC系統(tǒng)由五大核心模塊構(gòu)成，各模塊協(xié)同工作實現(xiàn)高效分離與分析：

1. 輸液系統(tǒng)（高壓泵與流動相管理）

• 高壓泵：提供穩(wěn)定、高壓的流動相輸送，確保溶質(zhì)在色譜柱中高效分離。泵的類型包括往復(fù)式柱塞泵（單活塞/雙活塞）、隔膜型往復(fù)泵和氣動放大泵等，需滿足流量恒定、無脈動、抗溶劑腐蝕等要求。
• 流動相管理：
  • 儲液器：儲存流動相，通常一個儲液器盛裝一種流動相，避免混裝。
  • 脫氣裝置：去除流動相中的溶解氣體（如氧氣、空氣），防止氣泡進(jìn)入檢測器或色譜柱，影響分離效果。常用脫氣方法包括超聲波振蕩脫氣、惰性氣體鼓泡吹掃脫氣和在線真空脫氣。
  • 梯度洗脫裝置：通過程序控制流動相組成（如溶劑極性、離子強(qiáng)度、pH值等），實現(xiàn)復(fù)雜樣品的高效分離。梯度洗脫分為低壓梯度（外梯度）和高壓梯度（內(nèi)梯度）兩種方式。

2. 進(jìn)樣系統(tǒng)

• 手動進(jìn)樣器：采用六通進(jìn)樣閥，通過部分裝液法或完全裝液法進(jìn)樣。部分裝液法進(jìn)樣量應(yīng)不大于定量環(huán)體積的50%，完全裝液法進(jìn)樣量應(yīng)不小于定量環(huán)體積的5~10倍，以確保進(jìn)樣準(zhǔn)確度和重復(fù)性。
• 自動進(jìn)樣器：實現(xiàn)自動化進(jìn)樣，提高分析效率。需注意定期清洗樣品瓶、蓋和墊，避免交叉污染；長時間不使用時，需用甲醇置換系統(tǒng)中的腐蝕性流動相或洗液，防止細(xì)菌生長。

3. 分離系統(tǒng)（色譜柱與柱溫控制）

• 色譜柱：分離的核心部件，由柱管、壓帽、卡套、篩板、接頭等組成。柱內(nèi)填充固定相（如硅膠基質(zhì)鍵合相、離子交換樹脂等），其粒度、孔徑和表面性質(zhì)直接影響分離效果。
• 柱溫箱：控制色譜柱溫度，優(yōu)化分離條件。溫度變化會影響溶質(zhì)在固定相和流動相間的分配系數(shù)，從而影響分離效果和保留時間。
• 保護(hù)柱：安裝在色譜柱前端，防止樣品中的顆粒物或強(qiáng)保留物質(zhì)污染色譜柱，延長色譜柱使用壽命。

4. 檢測系統(tǒng)

• 紫外-可見光檢測器（UV-Vis）：常用的檢測器，通過測量樣品在特定波長下的吸光度進(jìn)行定量分析。具有靈敏度高、適用范圍廣等優(yōu)點。
• 二極管陣列檢測器（PDA）：可同時檢測多個波長下的吸光度，提供三維光譜圖，用于定性分析和峰純度鑒定。
• 熒光檢測器（FLD）：檢測熒光化合物，具有高靈敏度和高選擇性，常用于藥物和環(huán)境分析。
• 示差折光檢測器（RID）：測量流動相中溶質(zhì)引起的折射率變化，適用于紫外吸收率較低的化合物（如糖類和聚合物）。
• 蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）：測量被分析物顆粒對光的散射，適用于無紫外吸收或紫外吸收較弱的化合物（如脂類和某些聚合物）。
• 質(zhì)譜檢測器（MSD）：將HPLC分離與質(zhì)譜分析相結(jié)合，可對化合物進(jìn)行精確鑒定和定量，廣泛應(yīng)用于制藥、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究。

5. 數(shù)據(jù)記錄與處理系統(tǒng)

• 數(shù)據(jù)記錄儀：記錄檢測器輸出的電信號，生成色譜圖。
• 化學(xué)工作站：對色譜圖進(jìn)行處理和分析，計算峰面積、保留時間等參數(shù)，實現(xiàn)定量和定性分析。