【儀器科普】液相色譜儀（HPLC）的工作原理是什么？

一、工作原理：基于分配系數(shù)的差異實現(xiàn)分離

HPLC的核心原理是利用不同物質(zhì)在固定相（Stationary Phase）和流動相（Mobile Phase）之間的分配系數(shù)差異，實現(xiàn)混合物的分離。具體過程如下：

1. 流動相輸送：高壓泵將流動相（通常為有機溶劑與水的混合液）以恒定流速壓入系統(tǒng)，形成穩(wěn)定的液流。
2. 樣品注入：自動進樣器將微量樣品注入流動相，形成樣品帶。
3. 色譜柱分離：樣品隨流動相進入色譜柱（內(nèi)含固定相顆粒）。固定相的化學性質(zhì)或物理結構與樣品組分發(fā)生相互作用（如吸附、分配、離子交換等），導致各組分在柱內(nèi)停留時間不同。
4. 檢測與記錄：分離后的組分依次流出色譜柱，進入檢測器（如紫外-可見光檢測器、質(zhì)譜檢測器等），轉(zhuǎn)化為電信號并記錄為色譜圖。

二、系統(tǒng)組成：四大核心模塊協(xié)同工作

HPLC系統(tǒng)由四個關鍵模塊構成，各模塊協(xié)同實現(xiàn)高效分離：

1. 輸液系統(tǒng)
   • 高壓泵：提供穩(wěn)定壓力（通常1-40 MPa），確保流動相以恒定流速通過色譜柱。流速波動會影響分離重現(xiàn)性。
   • 梯度洗脫裝置：通過動態(tài)調(diào)整流動相組成（如極性），優(yōu)化復雜樣品的分離效果。例如，從低極性溶劑逐步過渡到高極性溶劑，可縮短分析時間并提高峰形對稱性。
2. 進樣系統(tǒng)
   • 自動進樣器：精確控制進樣量（通常0.1-100 μL），減少人為誤差。部分進樣器支持序列分析，可連續(xù)處理多個樣品。
3. 分離系統(tǒng)
   • 色譜柱：核心部件，內(nèi)裝固定相（如硅膠基質(zhì)、聚合物填料）。固定相的粒徑（通常1.8-10 μm）、孔徑及表面修飾決定分離效率。小粒徑填料可提高柱效，但需更高壓力。
   • 柱溫箱：控制色譜柱溫度（通常20-40℃），影響固定相與樣品的相互作用強度及流動相粘度，進而優(yōu)化分離條件。
4. 檢測與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
   • 檢測器：根據(jù)檢測原理分為通用型（如示差折光檢測器）和選擇性型（如熒光檢測器）。紫外檢測器因靈敏度高、適用范圍廣，成為常用類型。
   • 數(shù)據(jù)處理軟件：將電信號轉(zhuǎn)換為色譜圖，計算保留時間、峰面積等參數(shù)，實現(xiàn)定量分析。

三、分離機制：四種模式適配不同需求

HPLC的分離模式由固定相與流動相的性質(zhì)決定，常見類型包括：

1. 正相色譜（Normal-Phase HPLC）
   固定相為極性（如硅膠），流動相為非極性（如正己烷）。適用于分離極性差異較大的化合物，如脂溶性維生素。

2. 反相色譜（Reverse-Phase HPLC）
   固定相為非極性（如C18鏈），流動相為極性（如甲醇-水）。是應用廣泛的模式，適用于分離極性適中至非極性的化合物，如藥物、蛋白質(zhì)。

3. 離子交換色譜（Ion-Exchange HPLC）
   固定相帶電荷（如磺酸基或季銨基），通過靜電作用分離離子型化合物，如氨基酸、無機離子。

4. 尺寸排阻色譜（Size-Exclusion HPLC）
   固定相為多孔凝膠，根據(jù)分子大小分離，適用于大分子（如蛋白質(zhì)、聚合物）的分子量分布分析。

四、技術優(yōu)勢與應用場景

HPLC的優(yōu)勢在于高分離效率、短分析時間及對熱不穩(wěn)定化合物的適用性。其應用涵蓋：

• 醫(yī)藥領域：藥物純度檢測、代謝產(chǎn)物分析；
• 環(huán)境監(jiān)測：水中多環(huán)芳烴、農(nóng)藥殘留測定；
• 食品分析：添加劑、防腐劑定量；
• 生物研究：蛋白質(zhì)、多肽分離純化。

通過優(yōu)化固定相類型、流動相組成及柱溫等參數(shù)，HPLC可實現(xiàn)從簡單混合物到復雜生物樣本的高效分離，成為現(xiàn)代分析化學不可少的工具。