人腎細(xì)胞腺癌細(xì)胞，769-P

人腎細(xì)胞腺癌細(xì)胞，769-P實(shí)驗(yàn)步驟：在超凈臺(tái)內(nèi)，安裝好濾器。

用去離子水溶解1640培養(yǎng)基，并用磁力攪拌器攪拌2 h，使之充分溶解。

在超凈臺(tái)內(nèi)過(guò)濾。

分裝到250 mL的玻璃瓶?jī)?nèi)。

用封口膜封好，-20℃保存，過(guò)濾結(jié)束時(shí)，還要取少許培養(yǎng)基進(jìn)行菌培，驗(yàn)證培養(yǎng)基是否是無(wú)菌。

胎牛血清的處理：

沒(méi)有滅活的血清中含有補(bǔ)體成分，需要將血清在56℃條件下滅活30 min。在水浴鍋內(nèi)進(jìn)行，滅活的過(guò)程中，要不停地?fù)u晃，使受熱均勻，防止沉淀析出來(lái)。

 注意：

剛?cè)〕龅膬龃嫜宀灰⒓捶湃?6℃中，因?yàn)橥蝗坏臏囟壬邥?huì)使裝血清的玻璃瓶破裂，應(yīng)該放在室溫逐漸溶解，然后，再進(jìn)行滅活處理。

人腎細(xì)胞腺癌細(xì)胞，769-P生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配制：

90 mL IMDM中加入大約10 mL的胎牛血清（10% 左右），雙抗可以不加。

（有資料表明雙抗對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用）Hanks 和D-Hanks液，以及胰酶的配制Hanks液是一種常用的平衡鹽溶液，D-hanks液是不含鈣鎂的Hanks液。它們與細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況下的pH值和滲透壓一致，細(xì)胞在Hanks液中可生存幾個(gè)小時(shí)，Hanks液主要用于清洗細(xì)胞。

D-Hanks液主要用于配制胰酶。配制Hanks液需將CaCl2溶于蒸餾水，再將其它試劑配制成溶液，將兩次配制的溶液混合，定容。胰酶是一種常用的細(xì)胞消化液，在原代培養(yǎng)時(shí)，用胰酶消化，使細(xì)胞從組織塊中游離出來(lái)。

傳代培養(yǎng)時(shí)，用胰酶消化貼壁的細(xì)胞，并分散成單個(gè)細(xì)胞。

胰酶分離細(xì)胞的能力與不僅與胰酶作用的溫度、時(shí)間、濃度和pH有關(guān)，還與細(xì)胞的類(lèi)型和特性有關(guān)。

用于原代培養(yǎng)消化組織塊采用的濃度為：0.1% 或 0.125%；

用于傳代培養(yǎng)采用的胰酶濃度為：0.25%或者0.2%。

胰酶的配制：

1）由于胰蛋白酶的作用主要機(jī)制是通過(guò)螯合鈣鎂離子，而鈣鎂離子是保持細(xì)胞和細(xì)胞之間相互連接所必需的，所以，胰酶的配制用無(wú)鈣鎂的D-Hank液，避免鈣鎂離子干擾胰酶的活性。

2）胰酶在pH8.0時(shí)活性zui強(qiáng)，在過(guò)濾除菌前，須用NaHCO3干粉調(diào)溶液的pH值。

3）胰酶受熱容易分解，所以避免盛夏配制，在配制過(guò)程中，溫度保持在4℃，zui后-20℃凍存。反復(fù)凍溶會(huì)影響胰酶的活性，要分裝凍存。

4）血清能降低胰酶的活性，所以，在終止胰酶的消化反應(yīng)時(shí)，可加入含有血清的培養(yǎng)基。