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離心技術(shù)在使用Metrizamide梯度分離染色體中的應(yīng)用
本文講述使用Metrizamide梯度分離染色體的方法和步驟。
1. 細(xì)胞系和組織培養(yǎng)。中國倉鼠卵巢（CHO）和Hela細(xì)胞系在McCoy’s培養(yǎng)基中補(bǔ)加10%胎牛血清培養(yǎng)，用碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)，需要5%CO2。
2. 細(xì)胞同步化。為了在收獲時(shí)有更多的有絲分裂細(xì)胞，用0.06μg/mL乙酰甲基秋水仙堿累積有絲分裂細(xì)胞，通常能獲得94%~97%中期有絲分裂細(xì)胞群。
3. 中期染色體分離。分離緩沖液組成為：1.0mol/L 乙二醇（2-甲基-2，4-戊二醇），0.5mmol/L CaCl2和0.1mmol/L呱嗪-N，N’-雙-2-乙磺酸鈉（PIPES緩沖液，PH=6.8）。在Parr壓力容器里通過25psi（1.7MPa）氮?dú)饪栈饔闷扑榧?xì)胞。使用區(qū)帶轉(zhuǎn)子，用10%~50%蔗糖梯度1500g離心30分鐘染色體。
用Metrizamide等密度區(qū)帶法分離染色體步驟如下：
1. 用1%二甲基二氯硅烷（溶解在四四♥-♥氯氯♥-♥化化♥-♥碳碳里）把15ml Corex離心管處理5分鐘。
2. 在60~71.1℃把離心管烤干。
3. 把染色體懸液加在染色體緩沖液里（染色體緩沖液：0.75mol/L Metrizamide，5mmol/L NDA），并加到Corex離心管。
4. 在染色體懸液上鋪放0.35mol/L Metrizamide（溶解在5mmol/L NDA里）。
5. 在Sorvall RC-2B離心機(jī)、HB-4（甩開吊籃轉(zhuǎn)子）以16300g（10000r/min）離心10分鐘。
6. 用上取法從頂部收集梯度。
按照上述條件離心，染色體漂浮成一個(gè)尖銳的區(qū)帶，粘到離心管壁上的很少，并且大多數(shù)染色體是分散的。
湖南湘立研制生產(chǎn)的幾款醫(yī)用離心機(jī)可以用來進(jìn)行細(xì)胞分離，如DL5M/TDL5M兩種型號(hào)的低速冷凍離心機(jī)可用來進(jìn)行干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。XL03RH型控溫離心機(jī)（低速冷凍離心機(jī)）可用來進(jìn)行溫度敏感型人體細(xì)胞分離。
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