流式細(xì)胞實驗方法操作總結(jié)

（一）　原理

活細(xì)胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的第二抗體結(jié)合，根據(jù)所測定的熒光強度和陽性百分率即可知相應(yīng)抗原的密度和分布。

（二）　操作步驟

制備活性高的細(xì)胞懸液（培養(yǎng)細(xì)胞系、外周血單個核細(xì)胞、

胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞等均可用于本法）

↓

用10%FCS　 RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度為

5×106～1×107/ml

↓

取40μl細(xì)胞懸液加入預(yù)先有特異性McAb（5～50μl）

的小玻璃管或塑料離心管，再加50μl 1∶20（用DPBS

稀釋）滅活正常兔血清

↓4℃ 30min

用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2ml左右

1000rpm×5min

↓

棄上清，加入50μl工作濃度的羊抗鼠

（或兔抗鼠）熒光標(biāo)記物，充分振搖

↓　4℃ 30min

用洗滌液洗滌2次，每次加液2ml左右

1000rpm×5min

↓

加適量固定液（如為FCM制備標(biāo)本，一般加入

1ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察，

視細(xì)胞濃度加入100～500μl固定液）

↓

FCM檢測或制片后熒光顯微鏡下觀察

（標(biāo)本在試管中可保存5～7天）

（三）　試劑和器材

1.　各種特異性單克隆抗體。

2.　熒光標(biāo)記的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗體，滅活正常兔血清。

3.　10% FCS RPMI1640, DPBS、洗滌液、固定液（見附錄）。

4.　玻璃管、塑料管、離心機、熒光顯微鏡等。

（四）　注意事項

1.　整個操作在4℃下進行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN3，上述實驗條件是防止一抗結(jié)合細(xì)胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。

2.　洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細(xì)胞膜上一抗相結(jié)合，出現(xiàn)假陰性。

3.　加適量正常兔血清可封閉某些細(xì)胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。

4.　細(xì)胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。

附:

1. DPBS （×10, 貯存液）

NaCl 80g

KCl 2g 　　　　　蒸餾水加至1000ml

Na2HPO4 11.5g 臨用時用蒸餾水1∶10稀釋

KH2PO4 2g

2.　洗滌液

DPBS　　　　　　900ml

FCS 50ml （終濃度　5%）

4%NaN3 50ml （終濃度0.2%）

3.　固定液

DPBS　　　　1000ml

葡萄糖　　　　20g （終濃度2%）

甲　醛　　　　10ml

NaN3　　　0.2g （終濃度0.02%）

（一）不同來源樣品的處理

1. 培養(yǎng)細(xì)胞

（1）培養(yǎng)細(xì)胞用0.25%的胰酶消化。

（2）PBS或生理鹽水洗滌細(xì)胞2次，再用PBS或生理鹽水懸浮細(xì)胞，加入預(yù)冷的無水乙醇，終濃度為60%～70% ，快速混勻，并用封口膜封口，置4℃下可保存15天左右。

2. 新鮮標(biāo)本

（1）將標(biāo)本切成1～2mm3的小塊。

（2）PBS或生理鹽水清洗后去除上清，加入0.2%膠原酶（或0.15%胰蛋白酶）37℃消化10～30min（根據(jù)實驗及不同組織確定），并不斷振動。

（3）300目尼龍篩過濾，除去組織團塊，PBS洗滌2次，300g離心5min，獲得已消化的細(xì)胞。

3. 石蠟包埋標(biāo)本

（1）標(biāo)本在切片機上切取3～5片50μm厚的組織片。

（2）將切片*脫蠟，梯度乙醇（100%、95%、70%）及蒸餾水水化。

（3）0.5%胃蛋白酶（或胰蛋白酶）37℃消化30min，每隔10min振動1次。

（4）300目尼龍篩過濾，獲得的細(xì)胞懸液PBS洗滌2次，300g離心5min。

注意：脫蠟一定要*（若加入100%乙醇無絮狀物飄起即可）;切片厚薄適宜，太薄碎片多，影響FCM分析結(jié)果，太厚易造成脫蠟不凈;注意掌握消化時間，避免已釋放的細(xì)胞被消化。

（二）直接免疫熒光標(biāo)記的樣品制備

用標(biāo)有熒光素的特異抗體對細(xì)胞進行直接染色，然后用流式細(xì)胞儀檢測，陽性者即表示有相應(yīng)抗原存在。實驗步驟如下：

1. 每份取100μl單細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度約1×106個細(xì)胞）。

2. 一份加入相應(yīng)量的FITC或PE標(biāo)記的特異性熒光直標(biāo)單抗，另一份加入熒光標(biāo)記的無關(guān)單抗，作為同型對照樣品。

3. 室溫下避光反應(yīng)一定時間（時間長短根據(jù)試劑說明書要求進行），一般在室溫下反應(yīng)15～30min即可。

4. 加入500μl PBS重懸成單細(xì)胞懸液即可上機檢測。

（三）間接免疫熒光標(biāo)記的樣品制備

1. 取1×106個細(xì)胞/100μl，先加入一抗混勻，置室溫下避光反應(yīng)30min。

2. 用PBS洗滌細(xì)胞2次，離心沉淀棄掉上清液（離心轉(zhuǎn)數(shù)一般為800～1000rpm，5min）。

3.用100μl PBS重懸細(xì)胞，再加入FITC或PE標(biāo)記熒光二抗（用量均按說明書要求加入）混勻，室溫下反應(yīng)30min。

4. 用PBS再洗滌細(xì)胞2次，加入500μl PBS重懸成單細(xì)胞懸液，上機檢測。

注意：以上兩種染色方法的抗體加入量和反應(yīng)時間，一般根據(jù)試劑使用說明書的要求進行。若說明書上未說明，應(yīng)*行預(yù)實驗，掌握好劑量與*反應(yīng)時間后，再進行流式樣品的制備。制備好的樣品，若不能及時上機檢測，用1%～4%的多聚甲醛固定，4℃下可保存5天。

（四）DNA熒光染色的樣品制備

DNA是細(xì)胞內(nèi)含量比較恒定的參量，隨著細(xì)胞增殖周期的各時相而發(fā)生變化。熒光染料（如PI）可選擇性地定量嵌入核酸（DNA/RNA）的雙螺旋堿基之間，與細(xì)胞特異性結(jié)合，DNA含量與熒光染料的結(jié)合量成正比，因此通過測定熒光強度可獲知細(xì)胞的增殖情況。

1. 將固定過的細(xì)胞離心（500～1000rpm，5min）棄上清液，再用PBS洗滌2次。

2. 用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度，每份為1×106個細(xì)胞/100μl。

3. 加入1000μl DNA 熒光染料（通常用Coulter公司提供的DNA染色試劑盒），室溫下避光染色15 min。

4. 上流式細(xì)胞儀檢測。

以上樣品的制備可分析細(xì)胞周期各時相的百分比，同時可粗略觀察有無凋亡細(xì)胞現(xiàn)象，如果用對照液（雞紅細(xì)胞）作參照標(biāo)準(zhǔn)，可進行細(xì)胞DNA倍體分析，通過DNA指數(shù)（DNA index，DI）衡量DNA的相對含量，DI可用下式計算：

DI=樣品G0/G1期的均值/正常二倍體細(xì)胞G0/G1期均值

（五）細(xì)胞凋亡檢測樣品的制備

根據(jù)實驗方案誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，制備單細(xì)胞懸液，使用 Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，通過Annexin V抗體與磷脂絲氨酸（PS）的特異性結(jié)合來檢測細(xì)胞凋亡的情況。

1. 將10×的結(jié)合緩沖液用蒸餾水稀釋成為1×，冰育。

2. 懸浮細(xì)胞在低溫環(huán)境中，用PBS洗滌細(xì)胞2次（800～1000rpm離心，5min）。

3. 棄上清，加入490μl預(yù)冷的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞（細(xì)胞濃度為105～106/ml）。

4. 加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI于細(xì)胞懸浮液中，輕輕混勻。

5. 將試管置于冰上，避光孵育10分鐘。

6. 上FCM檢測。

（六）微量全血法免疫熒光標(biāo)記的樣品制備

目前制備全血細(xì)胞樣品的方法很多，且很成熟，常用的方法是用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，然后進行特異性熒光染色，其染色方法與前面介紹的方法相同。下面主要介紹與流式細(xì)胞儀配套的Q-PREP（免疫學(xué)樣品處理器）進行快速制備微量全血樣品的方法。

1. 微量全血直接熒光染色法

（1）取肝素或EDTA抗凝全血（100μl/份），置12×75mm塑料試管中。

（2）每份加入20μl特異性熒光單抗，另一份加入熒光標(biāo)記的無關(guān)單抗作同型對照，室溫下避光染色15min。

（3）置 Q-PREP 儀上溶解紅細(xì)胞、穩(wěn)定和固定白細(xì)胞，靜置5min。

（4）上流式細(xì)胞儀檢測。

2. 微量全血間接熒光染色法

（1）取肝素或EDTA抗凝全血（100μl/份），置12×75mm塑料試管中。

（2）加入50μl特異的單克隆抗體（一抗），室溫下孵育30min。

（3）置Q-PREP儀上溶解紅細(xì)胞，穩(wěn)定和固定白細(xì)胞。

（4）離心（800～1000rpm，5min）棄上清液，用PBS洗滌細(xì)胞2次。

（5）加入50μl熒光（FITC或PE）標(biāo)記的第二抗體，室溫下避光染色30min。

（6）上流式細(xì)胞儀檢測。

3. 注意事項

（1）新鮮全血一般室溫下放置8小時以內(nèi)可以使用，時間過長會使活性降低，影響測定結(jié)果。

（2）抗凝血應(yīng)保證無血塊凝集。

（3）全血加入試管中時，應(yīng)盡量避免加到試管壁上，如沾到了管壁上必須用用棉簽擦凈，否則會影響細(xì)胞二維點圖的細(xì)胞群的分離效果。

（七）樣品制備應(yīng)注意的問題和影響因素

1. 樣品制備應(yīng)注意的問題

（1）單細(xì)胞懸液的制備是流式細(xì)胞術(shù)分析的關(guān)鍵。如遇有細(xì)胞團塊應(yīng)先用300～500目的細(xì)胞篩網(wǎng)過濾后，再上機檢測。

（2）標(biāo)本采集后要及時固定或深低溫保存，手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本或活檢針吸標(biāo)本取材時，要避免出血與壞死組織。

（3）免疫熒光標(biāo)本應(yīng)注意死細(xì)胞和碎片的去除，要求每份樣品中雜質(zhì)、碎片、團塊重疊細(xì)胞應(yīng)<2%，尤其是細(xì)胞或細(xì)胞亞群的測定時，否則這些細(xì)胞的非特異性熒光增加，會干擾免疫熒光測定。

（4）細(xì)胞樣品的采集要保證足夠的細(xì)胞濃度，一般每份樣品要求的細(xì)胞數(shù)為5×105/ml～1×106/ml，對腫瘤細(xì)胞DNA異倍體的樣品分析，至少應(yīng)有20%的腫瘤細(xì)胞存在（占主峰1/5以上的異倍體才可確認(rèn)為異倍體峰）。

（5）石蠟包埋組織單細(xì)胞制備時要注意：選取含待測細(xì)胞豐富的區(qū)域;石蠟組織片的厚度要適宜，為40～50μm;*脫蠟，以免殘留的石蠟影響酶的消化活性;充分水化，使組織還原到與新鮮組織相似的狀態(tài)。

2. 影響樣品制備的因素

（1）溫度對熒光強度的影響：一般認(rèn)為，溫度升高時熒光減弱，所以在熒光測量時要保持染色后的樣品在適當(dāng)?shù)蜏丨h(huán)境下進行，并盡可能減少樣品的光照射時間。有條件時，應(yīng)使樣品觀察室做到恒溫裝備，使溫度對熒光染色的影響減少到zui小，會得到更好的熒光定量測定的結(jié)果。

（2）pH值對熒光強度的影響：每一種熒光染料分子發(fā)光的zui高量子產(chǎn)額，都有自己的pH值，以保持熒光燃料分子與溶劑間的電離平衡，如果pH值發(fā)生改變，可能造成熒光光譜的改變，如FITC在酸性溶劑中呈藍(lán)色熒光，為陽離子發(fā)光;在堿性溶劑中呈黃綠色熒光，為陰離子發(fā)光。

同型對照

1、同型對照不是的。同型對照雖然與試驗抗體是同種型，而且具有相同的熒光標(biāo)記，但不一定是同一廠家生產(chǎn)的，肯定不是同一批次的，也很難保證每個抗體上標(biāo)記的熒光分子的數(shù)目是相同的，所以很多情況下發(fā)現(xiàn)用同型對照調(diào)的參數(shù)并不合適。

2、是否需要同型對照取決于要檢測的指標(biāo)。

（1）對于一些細(xì)胞特異性的亞群標(biāo)志，比如CD3/4/8這些，對于某一細(xì)胞來說它或者表達(dá)，或者不表達(dá)，這時只要抗體和標(biāo)記技術(shù)沒問題都會清晰分群，無需同型對照，甚至不需要陰性對照。

（2）某些分子在細(xì)胞上原本不表達(dá)，或表達(dá)極低，加入處理因素后表達(dá)明顯上調(diào)，這種通常也能明顯分群，也不需要同型對照，但要有未加處理因素的陰性對照。檢測細(xì)胞表面活化分子的表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)因子檢測等通常是這種情況。

（3）如果細(xì)胞群中大部分細(xì)胞都表達(dá)要檢測的目標(biāo)分子，只是有的表達(dá)高些，有的表達(dá)低些，通常細(xì)胞不能明顯分群。此時通常需要以同型對照做參考，雖然它也不一定正確。

IgG-FITC同型（IgG1 or IgG2a or IgG2b, etc.）

封閉情況

對于表面分子，可以不設(shè)同型對照，對于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子，應(yīng)設(shè)同型對照，有利于對照陽性染色是否成功，以及分析時設(shè)定gate。如果是mice cell, 實在不設(shè)也可以，目前為止，我看Isotype似乎都沒反應(yīng)。

如果嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖隽魇?都是應(yīng)該做同型對照的,據(jù)我們自已做的經(jīng)驗,特別是以下幾種情況是做同型對照:

1 自已標(biāo)記的抗體:許多做單抗實驗室自已標(biāo)記抗體的（國內(nèi)許多*的抗體實驗室在內(nèi)）,但這種自已標(biāo)記的抗體,我們做同型對照經(jīng)常會與不做同型有很大的區(qū)別

2 一些表達(dá)比較低的分子:有些表達(dá)比較低的分子,特別是表面分子,做同型后的結(jié)果甚至?xí)霈F(xiàn)陽性與陰性之間的明顯差異,這種事我們也經(jīng)歷過多次了.

熒光標(biāo)記一抗的同型對照抗體只是缺了決定特異結(jié)合的Fc段。非熒光標(biāo)記一抗的同型對照更簡單，就是熒光二抗。

封閉（blocking）是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程?？乖蚩贵w包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類似。zui常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其zui大的特點是價廉，可以高濃度使用（5%）。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復(fù)雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。

脫脂牛奶，BSA，或者FCS，在ELISA及WB中用它們主要有兩個原因：

一是它們做為隋性蛋白，用來封閉酶標(biāo)板或膜上的蛋白結(jié)合位點，使其后的蛋白不會因為非特異結(jié)合而影響本底（即所謂封閉）;

二是在抗體等蛋白稀釋到很低濃度時會不穩(wěn)定，它們可以起到保護，或穩(wěn)定的作用，基本上可以理解為競爭關(guān)系。

封閉是沒有特異性的，所有的抗原表位都被結(jié)合了。

但非特異性結(jié)合容易被競爭替換，而特異性結(jié)合很難被競爭替換。

所以封閉主要是針對一抗的，沒有對二抗封閉的。