染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）技術(shù)的難點(diǎn)

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，簡稱ChIP）是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的一種技術(shù)。它利用抗原抗體的特異性反應(yīng)，可以真實(shí)地反映體內(nèi)蛋白分子與基因組DNA結(jié)合的狀況。下面我們就zui基本的實(shí)驗(yàn)步驟，實(shí)驗(yàn)中的小技巧以及需要注意的問題簡單介紹一下。

1.  細(xì)胞固定
甲醛能有效的使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-DNA，蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián)，形成生物復(fù)合體，防止細(xì)胞內(nèi)組分的重新分布。交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%，交聯(lián)時(shí)間通常為5分鐘到1個(gè)小時(shí)。需注意的是，交聯(lián)時(shí)間如果過長，細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響ChIP結(jié)果，而且實(shí)驗(yàn)材料也容易在離心過程中丟失。交聯(lián)時(shí)間如果過短，則交聯(lián)不*，產(chǎn)生假陰性。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)可被加入的甘氨酸終止。
2.  染色質(zhì)片段化
交聯(lián)后的染色質(zhì)需被超聲波切成400~600 bp的片段，以便目的蛋白的暴露，利于抗體識(shí)別，其片段破碎的均勻一致性對(duì)結(jié)果影響至關(guān)重要。傳統(tǒng)的超聲波破碎是利用機(jī)械力斷裂染色質(zhì)，容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫，這都會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而影響ChIP的效率。而來自比利時(shí)的Bioruptor非接觸式超聲波破碎儀采用溫和的破碎方式，保證了蛋白的活性，DNA破碎效果均一，同時(shí)外接水循環(huán)儀保證了實(shí)驗(yàn)的溫度穩(wěn)定性，成為目前ChIP實(shí)驗(yàn)的。
3.  染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)
Input對(duì)照：
在進(jìn)行免疫沉淀前，需要取一部分?jǐn)嗔押蟮娜旧|(zhì)做Input對(duì)照。Input需要與沉淀后的樣品DNA一起經(jīng)過逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，DNA純化，以及zui后的檢測。Input對(duì)照不僅可以驗(yàn)證染色質(zhì)斷裂的效果，還可以根據(jù)Input中的靶序列的含量以及染色質(zhì)沉淀中的靶序列的含量，按照取樣比例換算出ChIP的效率，所以Input對(duì)照是ChIP實(shí)驗(yàn)*的步驟。
Beads選擇：
接下來，利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過抗原-抗體特異反應(yīng)形成DNA-蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物，然后使用Agarose beads或Magnabeads沉淀此復(fù)合物，特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段。再經(jīng)過多次洗滌，除去非特異結(jié)合的染色質(zhì)后，用SDS+NaHCO₃洗脫免疫沉淀復(fù)合物。

抗體選擇：
染色質(zhì)免疫沉淀所選擇的目的蛋白的抗體是ChIP實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)與染色質(zhì)交聯(lián)結(jié)合時(shí)，抗體的抗原表位可能因?yàn)榕c結(jié)合位點(diǎn)的距離太近，不能被抗體識(shí)別，所以不能有效地在體內(nèi)形成免疫沉淀復(fù)合物，直接影響ChIP的結(jié)果。

陰性對(duì)照設(shè)置：
在做ChIP實(shí)驗(yàn)時(shí)，需設(shè)置對(duì)照，以便于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性進(jìn)行評(píng)估。陽性抗體和陰性抗體對(duì)照是zui基本的實(shí)驗(yàn)對(duì)照。陽性抗體通常選擇與已知序列相結(jié)合的比較保守的蛋白的抗體，常用的包括組蛋白抗體或RNAPolymerase II抗體等。陰性抗體通常選擇目的蛋白抗體宿主的IgG或血清。目的蛋白抗體的結(jié)果與陽性抗體和陰性抗體的結(jié)果相比較，才能得出正確結(jié)論。另外，還應(yīng)考慮目的蛋白抗體與DNA的非特異性結(jié)合的可能，所以通常還會(huì)選擇一對(duì)陰性引物，即目的蛋白肯定不會(huì)結(jié)合的DNA序列，作為該抗體的陰性對(duì)照。*的陰性對(duì)照引物是在靶序列上游的一段與目的蛋白肯定不能結(jié)合的序列。如果目的蛋白沒有商品化的適用于染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的抗體，只有其他用途的抗體時(shí)，可以先做蛋白質(zhì)免疫沉淀檢測。如果抗體可以成功的沉淀蛋白，再進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的檢測。
4.  交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)和DNA的純化
用不含DNase的RNase和Proteinase K，65℃保溫6小時(shí)逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，經(jīng)DNA純化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化DNA。在逆轉(zhuǎn)交聯(lián)時(shí)不使用Proteinase K，然后用丙酮回收有機(jī)相中的蛋白質(zhì)，進(jìn)行分析。
5.  DNA的鑒定
zui常用的DNA的鑒定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于啟動(dòng)子區(qū)域序列多樣性的特點(diǎn)，所以不同的細(xì)胞系或不同的動(dòng)物品系的同一基因的啟動(dòng)子序列有可能不同，因此可設(shè)計(jì)多對(duì)引物來反復(fù)驗(yàn)證ChIP實(shí)驗(yàn)的結(jié)果.