PCR引物設(shè)計實(shí)驗(yàn)

引物設(shè)計是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，在核酸合成反應(yīng)時，作為每個多核苷酸鏈進(jìn)行延伸的出發(fā)點(diǎn)而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯鏈形式進(jìn)行合成，因此引物的3′-OH，必須是游離的。

1、長度：15—30bp，其有效長度[Ln=2(G十C)十(A十T)]一般不大于38，否則PCR的適延伸溫度會超過Taq酶的作用溫度(74度)，從而降低產(chǎn)物的特異性。
2、G十C含量：應(yīng)在40%一60%之間，PCR擴(kuò)增中的復(fù)性溫度一般較Tm值低等于引物的Tm值減去5—10度。引物長度小于20時，其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。
3、堿基分布的隨機(jī)性：應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)4個以上的單一堿基。尤其是不應(yīng)在其3’端出現(xiàn)超過3個的連續(xù)G或C，否則會使引物在G十C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。
4、引物自身：不能含有自身互補(bǔ)序列，否則會形成發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)。
5、引物之間：兩個引物之間不應(yīng)有多于4個的互補(bǔ)或同源堿基，不然會形成引物二聚體，尤應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊。
6、上下游引物的互補(bǔ)性：一個引物的3‘末端序列不允許結(jié)合到另一個引物的任何位點(diǎn)上。
7、3’末端：如果可能的話，每個引物的3‘末端堿基應(yīng)為G或C。
8、引物應(yīng)當(dāng)超出限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)至少3個核苷酸。