T9298 T4 DNA 連接酶 T4 DNA ligase 核酸檢測(cè)

諾博萊德  T4 DNA 連接酶 T4 DNA ligase

T4 DNA 連接酶 T4 DNA ligase   核酸檢測(cè)

產(chǎn)品貨號(hào)：T9298

產(chǎn)品名稱：T4 DNA 連接酶 T4 DNA ligase

英文名稱：T4 DNA ligase

產(chǎn)品別名：T4 DNA連接試劑盒

產(chǎn)品規(guī)格：60U

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

儲(chǔ)存條件：Store at -20℃

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyderT9298  T4 DNA 連接酶 T4 DNA ligase特性：

高效連接粘性末端和平末端

T/A 克隆

dsDNA 切刻修復(fù)

構(gòu)建高豐度克隆文庫(kù)

RNA 和 DNA 的連接

概述：

該酶催化雙鏈 DNA 或 RNA 上相鄰的 5′-磷酸末端和 3′-羥基末端形成磷酸二酯鍵。該酶不僅能夠催化平齊末端或粘性末端之間的連接，還可以修復(fù)雙鏈 DNA、RNA 或 DNA/RNA 雜交雙鏈中的單鏈切刻。

來(lái)源：

純化自 E. coli C600 pcl857 pPLc28 lig8。

反應(yīng)條件：

1X T4 DNA 連接酶反應(yīng)緩沖液

[50 mM Tris-HCl（pH 7.5 @ 25℃），10 mM MgCl2，10 mM DTT，1 mM ATP]。推薦 DNA 5′ 末端濃度為 0.1-1.0 μM，16℃ 溫育。

熱失活：65℃ 10 分鐘。

單位定義（粘性末端活性單位）：

1 單位指在 20 μl 1X T4 DNA 連接酶反應(yīng)緩沖液中，16℃ 反應(yīng)條件下，30 分鐘能使 50% 的經(jīng) HindⅢ 消化的λDNA 片段 [ 5′ 端濃度為 0.12 μM（300 μg/ml）] 連接所需的酶量。

注意事項(xiàng)：

與 E. coli DNA 連接酶需要 NAD+ 作輔因子不同，T4 DNA 連接酶的輔因子是 ATP。

稀釋后的 T4 DNA 連接酶應(yīng)于 -20℃、50% 甘油貯存緩沖液（稀釋緩沖液 A，NEB #B8001）中保存。如稀釋后馬上使用，也可用 1X T4 DNA 連接酶反應(yīng)緩沖液稀釋。

只要在反應(yīng)體系中補(bǔ)加 1 mM ATP，連接反應(yīng)就可以在 NEB 提供的四種限制性內(nèi)切酶緩沖液或在T4 DNA 多聚核苷酸激酶反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行。

使用示例：

1、先將 10×T4DNALigaseBuffer 在冰上融化，并進(jìn)行短暫的離心。

2、以 20μL 連接體系示例，在無(wú)菌微量離心管中加入以下各種成分：

【注】：平末端載體與DNA片段進(jìn)行連接時(shí)，應(yīng)先將載體進(jìn)行去磷酸化處理，以防發(fā)生自連接現(xiàn)象。為提高連接效率，每20µL反應(yīng)體系中可以加2µL50%PEG4000。

3、16℃連接過(guò)夜。

4、轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

1）將連接產(chǎn)物加入到100µL 感受態(tài)細(xì)胞中（連接產(chǎn)物不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞的1/10），輕彈混勻，冰上孵育30min。

2）將離心管于42℃，熱激90sec（不要晃動(dòng)），之后立刻置于冰水浴靜置2-3min。

3）向離心管中加入900µLLB或SOC培養(yǎng)基，37℃，150rpm，振蕩培養(yǎng)45min，該過(guò)程使菌體復(fù)蘇，抗性基因表達(dá)。

4）2500 g 離心5min，吸去900µL上清，用剩余培養(yǎng)基重懸菌體，用無(wú)菌涂布棒將剩余菌體在正確抗性的平板上涂布均勻，待菌液被平板吸收后，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。

【注】：如果使用超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞（轉(zhuǎn)化效率＞108cfu/µg），可直接吸取100-200µL37℃孵育后的菌液涂板，剩余菌液可在4℃保存，1周內(nèi)均可重新涂板。

注意事項(xiàng)：

1、10×T4DNALigaseBuffer 中含有 ATP，為避免 ATP 的降解，建議解凍后分裝凍存于-20℃。

10×T4 DNA Ligase Buffer 在融解時(shí)，如果出現(xiàn)少量沉淀屬正常現(xiàn)象，請(qǐng)顛倒混勻后使用。

2、平末端的載體與 DNA 片段連接時(shí)，應(yīng)首先對(duì)載體進(jìn)行去磷酸化，以防止載體自身環(huán)化。

注意：如果向反應(yīng)體系中加入 PEG 可以促進(jìn)平末端的連接，但 PEG 可能導(dǎo)致cDNA 片段克隆產(chǎn)物 出現(xiàn)串聯(lián)體并抑制包裝的反應(yīng)。

3、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

4、本產(chǎn)品僅作科研用途！

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