細(xì)胞培養(yǎng)基

一、 細(xì)胞培養(yǎng)基的概念和原理
細(xì)胞培養(yǎng)基是人工模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長的營養(yǎng)環(huán)境，是提供細(xì)胞營養(yǎng)和促進(jìn)細(xì)胞生長增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。培養(yǎng)液或培養(yǎng)基的含義幾乎相同，英文都是medium。當(dāng)它是粉劑時，傾向性地稱為培養(yǎng)基，而將粉劑配成液體后，多稱為培養(yǎng)液。培養(yǎng)液中常常補(bǔ)加血清、抗生素等成分。培養(yǎng)基主要包括天然細(xì)胞培養(yǎng)基、合成和無血清等。

天然是人們早期采用的，直接取自于動物組織提取液或體液，如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。營養(yǎng)價值高，但成分復(fù)雜，差異大、不穩(wěn)定，來源也受到限制。水解乳蛋白和膠原是兩種較好的天然培養(yǎng)基，富含氨基酸。血清是天然培養(yǎng)基中zui有效和zui常用的培養(yǎng)基，但其組成成分復(fù)雜，其中一些成分與功能不明確。血清的來源有胎牛血清、小牛或成牛血清、馬血清、雞血清、羊血清及人血清，zui廣泛應(yīng)用的為胎牛血清和小牛血清。

合成是用化學(xué)成分明確的試劑配制的培養(yǎng)基，組分穩(wěn)定，主要包括糖類、必需氨基酸、維生素、無機(jī)鹽類等。自199 問世以來，合成發(fā)展至今已有幾十種，除了沿用半個世紀(jì)的基礎(chǔ)合成之外，近年來還出現(xiàn)了營養(yǎng)成分更加豐富的低血清。由于細(xì)胞種類和培養(yǎng)條件不同，適宜的合成也不同，在動物細(xì)胞培養(yǎng)中zui常用基礎(chǔ)有6～7 種，如BME、MEM、DMEM、HAM F12、PRMI1640、199 等。由于天然培養(yǎng)基的一些營養(yǎng)成分不能被合成*代替，因此一般需在合成中添加5％～10％的小牛血清。小牛血清的加入對細(xì)胞培養(yǎng)非常有效，但小牛血清的成分復(fù)雜，這對培養(yǎng)產(chǎn)物的分離純化和檢測會帶來一定的不便，為減少小牛血清的影響，開發(fā)了營養(yǎng)成分更加豐富的低血清，可以將小牛血清的使用量降低到1～3％。

無血清（serum free medium， SFM）是指在使用中無需添加血清的，且其組成成分不含有任何動物組分。按照其組分分類，還可以分為無動物組分無血清和化學(xué)限定無血清，前者組分中可能含有某些植物來源成分，而后者*由化學(xué)成分明確的組分組成。其中，無動物組分無血清是目前在生物制藥行業(yè)中應(yīng)用zui廣泛的，它提高了細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量，避免了使用血清帶來的麻煩。目前，已有多種無血清培養(yǎng)基上市，如雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基、CHO細(xì)胞無血清培養(yǎng)基、Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基和NS0 細(xì)胞無血清培養(yǎng)基等。無血清培養(yǎng)基通常添加生長附加成分，如激素與生長因子、低分子營養(yǎng)成分和轉(zhuǎn)鐵蛋白等促細(xì)胞生長的附加成分，一般包括胰島素、孕酮、腐胺、轉(zhuǎn)鐵蛋白等。

是細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)，它為動物細(xì)胞的健康快速成長提供營養(yǎng)物質(zhì)。所以只要用到細(xì)胞來制造生物技術(shù)產(chǎn)品，的重要作用就*。

二、的種類與基本成分

2.1 天然培養(yǎng)基
天然培養(yǎng)基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術(shù)建立早期，體外培養(yǎng)細(xì)胞都是利用天然培養(yǎng)基。但是由于天然培養(yǎng)基制作過程復(fù)雜、批間差異大，因此逐漸被合成培養(yǎng)基所替代。

2.1.1 小牛血清

用于細(xì)胞培養(yǎng)的血清主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養(yǎng)細(xì)胞的原因主要是來源充足、制備技術(shù)成熟、經(jīng)過長時間的應(yīng)用考驗(yàn)人們對其有比較深入的理解。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。小牛血清取自出生10～30 天的小牛；新牛血清取自出生24小時之內(nèi)的新生牛；胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛。顯然，胎牛血清是品質(zhì)zui高的，因?yàn)樘ヅ＿€未接觸外界，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對細(xì)胞有害的成分zui少。牛血清對絕大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞都是適合的，但并不排除在培養(yǎng)某種細(xì)胞時使用其他動物血清更合適。牛血清中含有豐富的細(xì)胞生長必須的營養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。

1) 血清主要作用

(1) 提供基本營養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生素、無機(jī)物、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等，是細(xì)胞生長必須的物質(zhì)。

(2) 提供激素和各種生長因子：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素（氫化ke的松、地塞米松）、類固醇激素（雌二醇、睪酮、孕酮）等。生長因子如成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。

(3) 提供結(jié)合蛋白：結(jié)合蛋白作用是攜帶重要的低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。結(jié)合蛋白在細(xì)胞代謝過程中起重要作用。

(4) 提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷，對培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用。

2) 優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)

血清是非常復(fù)雜的混合物，成分多樣，含有各種生理平衡的分子量差別很大的生物分子，有的對細(xì)胞生長有促進(jìn)作用，如含有攜帶激素、礦物質(zhì)、微量元素和脂類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等。血清能夠提供細(xì)胞貼壁因子和擴(kuò)散因子。血清中含有起穩(wěn)定作用和解毒的因子，能夠維持培養(yǎng)基的pH 值并抑制蛋白酶直接或間接的酶解。但是血清的加入也帶來了很多問題：
(1) 血清的成份可能有幾百種之多，目前對其準(zhǔn)確的成份、含量及其作用機(jī)制仍不清楚，尤其是對其中一些多肽類生長因子、激素和脂類等尚未充分認(rèn)識，這給研究工作帶來許多困難；

(2) 血清都是批量生產(chǎn)，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化和連續(xù)性受到限制；

(3) 不能排除血清中含有易變物質(zhì)，這被認(rèn)為是“瓶中惡化”的原因之一。

(4) 對大多數(shù)細(xì)胞，在體內(nèi)狀態(tài)，血清不是它們接觸的生理學(xué)液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)，血清可能促進(jìn)某些細(xì)胞的生長（成纖維細(xì)胞）同時抑制另一類細(xì)胞生長（表皮細(xì)胞）。

(5) 血清含一些對細(xì)胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細(xì)胞的多胺反應(yīng)（如精胺、亞精胺）形成有細(xì)胞毒性作用的聚精胺。補(bǔ)體、抗體、細(xì)菌毒素等都會影響細(xì)胞生長，甚至造成細(xì)胞死亡。

(6) 取材中可能帶入支原體、病毒，對細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響。

(7) 血清的使用使得實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化困難，其中的蛋白質(zhì)使得某些轉(zhuǎn)基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中分離純化工作很難完成。

(8) 大規(guī)模生產(chǎn)中，血清來源越來越困難，價格昂貴，是構(gòu)成生產(chǎn)成本的主要部分之一。

(9) 為了使與傳染源相關(guān)的風(fēng)險減少到zui低，存在多個國家間限制進(jìn)出口生物材料的法規(guī)。
2.1.2 水解乳蛋白

水解乳蛋白（Lactalbumin Hydrolysate ）為乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸。既可用于細(xì)菌微生物培養(yǎng)，又可用于動物細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)中一般為0.5％水解乳蛋白（經(jīng)平衡鹽溶解）與合成培養(yǎng)基（如MEM）按1:1混合使用。目前在生產(chǎn)中主要用于低鼠腎細(xì)胞等細(xì)胞的培養(yǎng)和維持。但是水解乳蛋白的使用也給生物制品的生產(chǎn)帶來一定的風(fēng)險。首先由于水解乳蛋白系或者制品帶來風(fēng)險。其次水解乳蛋白及含有動物組分培養(yǎng)基的使用，使生物制品下游處理變得復(fù)雜，這對于蛋白質(zhì)藥物顯得更加重要。因?yàn)閺膭游锛?xì)胞中生產(chǎn)生物藥品，其面臨的zui大困難就是如何去除內(nèi)源或同源蛋白。不確定的成分，像動物肽類物質(zhì)的引入，勢必會增加提取、分離、純化的步驟，一方面使成本提高，另一方面也會影響生物制品的產(chǎn)量和質(zhì)量。

2.2平衡鹽溶液

平衡鹽溶液（balanced salt solution，BSS ）簡稱鹽溶液，集緩沖液的緩沖能力、生理鹽水的等滲性以及培養(yǎng)液的營養(yǎng)供應(yīng)特點(diǎn)于一體，兼具維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)溶液的酸堿度、同時供給細(xì)胞生存所必需的能量和無機(jī)離子成分的作用。各種BSS的緩沖系統(tǒng)有所不同，其中以Hank’s液和Earle’s液為例，它們主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Earle’s (2.2 g/L)中比在Hank’s (0.35 g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO₂平衡，以維持溶液的pH值。Eagles液在空氣水平的CO₂ 中，溶液會變堿，Hank’s液在CO₂培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO₂培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Earle’s液，。如果僅僅是清洗將要在中儲存的組織，用Hank’s液就可以了。

一些BSS含有的Ca²⁺、Mg²⁺是細(xì)胞膜的重要組成成分，同時參與許多重要的細(xì)胞功能活動。但它們有使細(xì)胞凝集的作用，在配制分散細(xì)胞的消化液和特殊用途的細(xì)胞洗滌時，宜采用Ca²⁺、Mg²⁺含量較低的Dulbecco液或無Ca²⁺、Mg²⁺的D-Hanks液，或者PBS液。

2.3基礎(chǔ)培養(yǎng)基

2.3.1 概述

基礎(chǔ)主要包括199、MEM、RPMI-1640、DMEM 、DMEM/F12等。主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。人工合成培養(yǎng)基使用時還需添加一定量的血清使細(xì)胞生長和繁殖。

2.3.2 組成及作用

氨基酸：組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同的細(xì)胞對氨基酸的需求各異，但幾種必需氨基酸細(xì)胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，如組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等。其余非必需氨基酸，細(xì)胞可以自己合成，或通過轉(zhuǎn)氨作用由其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來。絕大部分細(xì)胞對谷氨酰胺有較高的要求，因?yàn)楣劝滨０肥亲鳛槟茉?/p>

及碳源物質(zhì)同時被細(xì)胞利用，是是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時，細(xì)胞生長不良而死亡，所以各種培養(yǎng)液中都含有較多的谷氨酰胺。細(xì)胞所能利用的氨基酸是L型同分異構(gòu)體，D型氨基酸不能被利用。
維生素：維持細(xì)胞生長的一種生物活性物質(zhì)，對細(xì)胞代謝有重大作用。它們在細(xì)胞中大多形成酶的輔基或輔酶，沒有它們，酶便沒有活性，代謝活動將無法進(jìn)行。維生素分為水溶和脂溶兩大類，的培養(yǎng)液中直接采用ATP和輔酶A。

葡萄糖：大部分培養(yǎng)基都以葡萄糖作為能量來源之一。

無機(jī)鹽：維持培養(yǎng)基滲透壓平衡，參與細(xì)胞的代謝活動。主要有Na+、K+、Ca²⁺、Mg²⁺等。Na⁺是細(xì)胞外液中zui主要的陽離子，對維持滲透壓的恒定有決定性的作用。K⁺主要分布在細(xì)胞內(nèi)液，細(xì)胞內(nèi)K⁺對于激活某些酶是必需的，并在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡上也有極重要意義。Ca²⁺在細(xì)胞外液中的作用是將組織內(nèi)部細(xì)胞之間相互粘著，在細(xì)胞內(nèi)參與許多重要的細(xì)胞生理活動，如傳導(dǎo)、參與肌肉細(xì)胞收縮等。在懸浮培養(yǎng)時，為了減少細(xì)胞的聚集和附著，要減少Ca²⁺的濃度。Mg²⁺是構(gòu)成細(xì)胞間質(zhì)的重要成分，對于細(xì)胞間相互穩(wěn)定結(jié)合有很重要的意義。磷的化合物對細(xì)胞物質(zhì)代謝和生理功能調(diào)控有重要作用。

其他成分：肽、核苷、嘌呤等?？蓭椭?xì)胞的克隆化培養(yǎng)及維持某些特殊細(xì)胞系的生長。