用噬菌體ElISA快速鑒定噬菌體展示蛋白的結(jié)合親和性

用噬菌體ElISA快速鑒定噬菌體展示蛋白的結(jié)合親和性

    單價(jià)噬菌體展示系統(tǒng)能使一個(gè)單獨(dú)的蛋白質(zhì)（或多肽）分子呈遞在噬菌體顆粒表面，這樣的蛋白質(zhì)與野生型pⅢ衣殼蛋白相連，作為融合蛋白在輔助噬菌體感染的大腸桿菌細(xì)胞中，由噬菌粒載體翻譯表達(dá)出來。這種展示系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)單價(jià)展示，是由于這種融合蛋白極少替代來自輔助噬菌體基因組的野生型pⅢ蛋白。這種展示可以是高度可變的，而這時(shí)這些噬菌體通常只有0.05％一5％才能真正展示出需要的蛋白質(zhì)。

    單價(jià)噬菌體展示的主要優(yōu)點(diǎn)是排除了多價(jià)噬菌體展示時(shí)會遇到的親和效應(yīng)（avidityeffect）。這樣保證了篩選的性，能把具有很高親和性（如Kd≈lnmol/L）的不同變異體區(qū)別開來。這種技術(shù)的應(yīng)用，包括提高了結(jié)合親和性或改變了結(jié)合特異性[1）的多肽的生成。實(shí)際上，這個(gè)過程中zui費(fèi)勁的部分就是對篩選出的突變蛋白的鑒定。

    現(xiàn)在已有兩種方法能加快對篩選出的蛋白的結(jié)合親和性的分析。一種方法是在被展示蛋白和作為錨定的pⅢ衣殼蛋白中插入琥珀中止密碼子，這樣，游離蛋白就能在非（琥珀）抑制性菌株中進(jìn)行表達(dá)。這樣便能使用分析結(jié)合性的標(biāo)準(zhǔn)方法，對于提率是一種改進(jìn)[61。不幸的是，這個(gè)方法的應(yīng)用受到一種趨勢的影響，即由有義密碼子（sense codon）代替琥珀終止密碼子而產(chǎn)生的變異體在篩選出的文庫中占優(yōu)勢，因?yàn)橛捎谌诤系鞍椎谋磉_(dá)和展示的提高，這種噬菌體具有巨大的選擇優(yōu)勢。尋找一個(gè)替代的方法，以忽略終止密碼子并能將每個(gè)基因都亞克隆人一個(gè)表達(dá)載體，顯然是更費(fèi)力的。

    第二種方法，也是本章的重點(diǎn)，是將噬菌體顆粒本身作為游離蛋白的替代物，以測定結(jié)合性。通過在溶液中不斷地加入靶標(biāo)蛋白，來競爭替代與噬菌體結(jié)合的固定化靶標(biāo)蛋白，然后進(jìn)行噬菌體結(jié)合性檢測。這種技術(shù)能快速地分析從單價(jià)噬菌體展示系統(tǒng)的篩選中分離出的變異體，也能用于評價(jià)那些用其他方法難以表達(dá)的定向變異體的親和性。用噬菌體結(jié)合性檢驗(yàn)方法來對結(jié)合親和性進(jìn)行評估是很困難的，因?yàn)橐粋€(gè)關(guān)鍵的變量，即被展示的蛋白質(zhì)的濃度是未知的。不過，對于一系列的變異體，則有可能得到ECso的比值，而這與它們的解離常數(shù)的比值是緊密相關(guān)的[7）。本章主要描述了在設(shè)計(jì)噬菌體結(jié)合性檢測時(shí)需要考慮的一些重要參數(shù)，并為怎樣進(jìn)行這些檢測提供了詳細(xì)的示例實(shí)驗(yàn)方案。

    噬菌體結(jié)合性檢測為鑒定大量的噬菌體并挑選出對后續(xù)實(shí)驗(yàn)zui合適的變異體提供了一種快速的方法。這種檢驗(yàn)對于了解噬菌體展示技術(shù)的潛力同樣是一個(gè)有效的手段。然而，噬菌體結(jié)合性檢測并不能zui終測定結(jié)合的親和性。無數(shù)的因素都能影響到結(jié)合的結(jié)果，包括噬菌體上融合蛋白的展示水平、未知的翻譯后修飾以及由展示蛋白的增加引起的親和效應(yīng)等。為了消除與噬菌體展示相關(guān)的可能的假象，有必要使用傳統(tǒng)的對純化后蛋白結(jié)合性的分析方法，對這些檢測試驗(yàn)鑒定出的*變異體進(jìn)行檢驗(yàn)和鑒定。

廈門慧嘉生物科技有限公司專業(yè)提供各品牌ELISA試劑盒

詳情請登入: http://www.biohj.com

查詢，或    ：sale@biohj.com