色譜手動(dòng)積分門道多，不懂可不行...

說(shuō)到色譜，積分可是大事，今天我們就講講積分的故事…

在我們要對(duì)色譜峰進(jìn)行積分計(jì)算之前，得先了解幾個(gè)概念：

定義

1、積分

指在信號(hào)中確定峰并計(jì)算其大小，積分包括以下操作及步驟：識(shí)別、校正、定量。

2、積分事件的參數(shù)控制

對(duì)于某個(gè)信號(hào)進(jìn)行積分時(shí)，軟件將識(shí)別每個(gè)峰的開(kāi)始和結(jié)束時(shí)間，并用豎線標(biāo)記這些點(diǎn)，尋找每個(gè)峰的峰頂點(diǎn)，確定保留時(shí)間/遷移時(shí)間，建立基線，以及計(jì)算每個(gè)峰的峰面積、峰高和峰寬。這些過(guò)程積分事件的參數(shù)控制。

3、自動(dòng)積分

自動(dòng)積分功能為設(shè)置初始事件提供開(kāi)始點(diǎn)。自動(dòng)積分功能設(shè)置以下參數(shù)：初始斜率靈敏度（閾值）、初始峰高、初始峰寬、初始小峰面積。

4、手動(dòng)積分

此類型的積分允許對(duì)選定的峰或峰組進(jìn)行積分，在的手動(dòng)積分范圍內(nèi)，將忽略此軟件的事件積分（初始小峰面積除外）。如果手動(dòng)積分出來(lái)的一個(gè)或多個(gè)峰低于小峰面積閾值，則此積分將被廢棄。手動(dòng)積分時(shí)間使用時(shí)間值。它們不會(huì)為信號(hào)漂移作調(diào)整。

在報(bào)告中，手動(dòng)積分提供以下功能：

§ 劃基線：為一個(gè)峰或一組峰劃基線的位置；

§ 負(fù)峰：何時(shí)將基線以下的面積當(dāng)作負(fù)峰處理；

§ 切線撇去：計(jì)算從主峰切線撇去的峰面積；

§ 分裂峰：用垂線分裂峰的點(diǎn)；

§刪除峰：從積分結(jié)果中刪除一個(gè)或多個(gè)峰。

積分參數(shù)

自動(dòng)積分主要是修改以下4個(gè)積分參數(shù)實(shí)現(xiàn)的，具體如下：

1、斜率靈敏度（Slope Sensitivity）

也稱閾值，指設(shè)置信號(hào)斜率的值，該斜率用于識(shí)別積分過(guò)程中峰的起點(diǎn)和終點(diǎn)。如何信號(hào)斜率大于“斜率靈敏度”值，將建立峰起點(diǎn)，如果信號(hào)斜率降到“斜率靈敏度”以下，將建立峰止點(diǎn)。

設(shè)置值越低，峰響應(yīng)越靈敏，當(dāng)然，不同品牌的儀器對(duì)設(shè)置值的響應(yīng)程度會(huì)有所區(qū)別。

2、峰寬值（Peak Width）

用于控制積分器的選擇性以區(qū)分峰與基線噪音。如果設(shè)置的初始峰寬太小，則可能將噪音當(dāng)作峰。如果寬峰與窄峰混在一起，可以選用運(yùn)行時(shí)間編程事件設(shè)定特定的峰寬。

3、小峰面積值（Area Reject）

根據(jù)峰面積來(lái)設(shè)置小于目標(biāo)峰面積的峰將不被積分也不會(huì)報(bào)告；

4、小峰高（Height Reject）

小目標(biāo)峰的高度，任何小于小峰高的峰將不被積分及報(bào)告。

了解完概念，咱們說(shuō)說(shuō)如何進(jìn)行積分計(jì)算？首先看一張圖：我在峰底下畫根線，這個(gè)線就是告訴軟件那個(gè)部分需要計(jì)入峰面積的計(jì)算。

我們說(shuō)過(guò)，美圖軟件簡(jiǎn)單好用容易上手，所以，大部分時(shí)候，我們的美圖軟件能自動(dòng)幫我們畫線。

這就是說(shuō)，我們的軟件能夠比較準(zhǔn)確的指認(rèn)出色譜峰，但是有些時(shí)候，軟件會(huì)犯傻，出現(xiàn)一些神作…

各位可能不知道，去韓國(guó)整容，大夫是要要先打草稿的，這一條條的線，就是草稿，草稿打的好，以后效果才好，所以，別小看這一堆線，這是成功的關(guān)鍵。

計(jì)算的效果如何，就全看這根線畫得準(zhǔn)不準(zhǔn)了，那么，這個(gè)線到底該怎么畫…

積分計(jì)算

首先，我們得知道到底怎么把一個(gè)“峰”認(rèn)為是一個(gè)峰：

其實(shí)軟件看判斷峰是不是峰是有“套路”的，有一些指標(biāo)的。靠一些數(shù)字閾值來(lái)確認(rèn)的。各家軟件里一定都有，而且對(duì)各個(gè)參數(shù)的指認(rèn)也有不同的算法和單位，都說(shuō)出來(lái)太亂，而且估計(jì)大家也懶的看，總結(jié)了一下，軟件看峰的標(biāo)準(zhǔn)就是：

太陡了不積，太緩了也不積

太小了不積，太大了也不積

太矮了不積，太高了也不積

太胖了不積，太瘦了也不積

不讓積的時(shí)候，堅(jiān)決不積

知道了這些套路，還怕啥子積分，當(dāng)然，這還有什么其他用呢？

如果峰長(zhǎng)得太丑，會(huì)不會(huì)給積分呢？當(dāng)然不會(huì)，軟件不認(rèn)啊，當(dāng)然也不給積分了。

那如果，長(zhǎng)得特別丑的峰被積分了，怎么辦？嘿嘿，你懂的，暗箱操作，改規(guī)矩唄...

修改規(guī)則這個(gè)事兒，在咱們的軟件里，叫做調(diào)整積分參數(shù)，目的就是讓咱們把那根線劃得剛剛好，讓想積分的峰積分上，這是一個(gè)很有技巧的事情，尤其是對(duì)于一些長(zhǎng)相奇葩的峰，這條線怎么劃，就更是有學(xué)問(wèn)了。對(duì)于這樣不太合格的峰，如果我們能調(diào)節(jié)參數(shù)讓積分線盡量能吧這些峰畫出來(lái)，那也就能勉強(qiáng)擠入選擇范圍了，這種修改積分規(guī)格的情況叫做，手動(dòng)干預(yù)，當(dāng)然，軟件越，劃線的手法也越厲害，比如上面的圖和下面的圖其實(shí)都是同一種情況，但是軟件如果厲害點(diǎn)，就會(huì)把直的積分線掰彎，讓面積計(jì)算更準(zhǔn)點(diǎn)。

但可是，很多時(shí)候，我們不管怎么調(diào)，都找不出一個(gè)合適的組合將特別丑的峰積分，這個(gè)時(shí)候，該怎么辦？這個(gè)時(shí)候，我們就該用更深的套路了，那個(gè)特別丑的峰必須積分…強(qiáng)行在那個(gè)特別丑的峰上劃條線…這個(gè)行為，叫做“手動(dòng)積分”，這是積分界的大殺器，它說(shuō)積誰(shuí)就積誰(shuí)，就是這么霸氣。

雖然霸氣，但是麻煩也很多…尤其在法規(guī)實(shí)驗(yàn)室這種監(jiān)管森嚴(yán)的地界，一旦出現(xiàn)修改規(guī)則的事兒，要是沒(méi)有能讓人信服的理由，那事情可就鬧大了。

而管這個(gè)事的就是大名鼎鼎的FDA。

積分步驟

在軟件自動(dòng)積分完成以后，如果根據(jù)我們數(shù)據(jù)處理方法中預(yù)設(shè)的積分參數(shù)得到的計(jì)算機(jī)過(guò)一切正常的話，皆大歡喜，分析完成出報(bào)告

如果，你發(fā)現(xiàn)了一點(diǎn)小問(wèn)題，比如有些峰沒(méi)有被正確的積分出來(lái)，這個(gè)時(shí)候，我們就要走到第二個(gè)十字路口了，這些峰，到底是積還是不積…

到底該走哪邊，主要還是看峰沒(méi)有被正確積分的原因，

由于分離度或靈敏度低導(dǎo)致的峰沒(méi)有正確指認(rèn)，

基線漂移導(dǎo)致的誤判，

保留時(shí)間微小變化導(dǎo)致的誤判，

峰型變化比如拖尾導(dǎo)致的誤判等。。。

當(dāng)然，這些都是可能原因之一，具體什么原因，這需要各位根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的要求和方法的具體情況具體判斷，但是，有些情況是禁止的：

那就是好好的一個(gè)峰，但是非要亂劃線以使它能夠滿足系統(tǒng)適應(yīng)性或者測(cè)試結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)要求的情況。基本我們的數(shù)據(jù)的命運(yùn)就決定了，被淘汰的，就要啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)室調(diào)查了，而有些峰，還有一次機(jī)會(huì)被重新審查，進(jìn)入手動(dòng)積分階段，不過(guò)，到底是小改干預(yù)一下，還是要玩大的顛覆規(guī)則，那就要看峰自己的造化了

如果峰的毛病不大，只是暫時(shí)發(fā)揮失常，我們只要稍微調(diào)整下積分參數(shù)的設(shè)置就可以讓他們重回正常的積分狀態(tài)，那我們只需進(jìn)行手動(dòng)干預(yù)就可以

比如由于保留保留時(shí)間微小漂移的峰，我們可以適當(dāng)調(diào)整時(shí)間窗口，或者是由于靈敏度問(wèn)題的峰，我們可以適當(dāng)調(diào)整峰高接受的閾值，他們就可以被正確積分。

但是有些峰，走型比較嚴(yán)重，比如比較嚴(yán)重的拖尾或者基線漂移，實(shí)在是超出了軟件自己解決問(wèn)題的能力，那這個(gè)時(shí)候，我們只能親自操刀來(lái)劃那條線了，這個(gè)事情很重要，必須要親歷親為，小心謹(jǐn)慎。

這遍套路，聽(tīng)著講下來(lái)，好像挺流暢，不過(guò)，好腦子不如爛筆頭，在實(shí)驗(yàn)室里，一定要把套路記錄下來(lái)，形成自己門派的獨(dú)門秘籍，這個(gè)獨(dú)門秘籍，就是SOP，關(guān)于手動(dòng)積分，如何判斷，如何使用，自己的實(shí)驗(yàn)室里一定要結(jié)合自己的標(biāo)準(zhǔn)和情況制定一個(gè)SOP，這個(gè)SOP里一定要說(shuō)明：

重新積分的原因，這是針對(duì)個(gè)十字路口的

允許重新積分的情況，這是針對(duì)第二個(gè)十字路口的，任何不滿足的這些情況的數(shù)據(jù)，不應(yīng)該重新積分，而應(yīng)該啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)室調(diào)查。

重新積分使用的原理和方法

SOP猶如武功秘籍，不過(guò)接下來(lái)，要想練功，使用這個(gè)SOP，還得遵守一些江湖規(guī)矩：

重新積分的操作要經(jīng)過(guò)相關(guān)權(quán)限人員管理者授權(quán)后才能進(jìn)行，并且需要具有相應(yīng)權(quán)限的人員進(jìn)行操作，所以，進(jìn)行手動(dòng)積分操刀的，一定得是行家。

所有偏離SOP的偏差都應(yīng)該在分析報(bào)告中討論，這叫亡羊補(bǔ)牢，避免下次走上同一條不歸路。

色譜積分參數(shù)和重新積分的情況，初始和終積分?jǐn)?shù)據(jù)都應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行記錄并且經(jīng)過(guò)復(fù)核，歸檔保存，這是為了留下證據(jù)，防止以后死無(wú)對(duì)證。

這么一看，要想搞定手動(dòng)積分，還真是要花上不少心思，所以，建議就是：

與其潛心鉆研怎么搞好手動(dòng)積分，寫好SOP，遵守規(guī)章制度，不如當(dāng)初把方法做好一點(diǎn)，把可能分不好的峰都分開(kāi)，峰型不好的給調(diào)好，選好合適的梯度和檢測(cè)波長(zhǎng)減小基線漂移等等，這樣可以達(dá)到一勞永逸的效果。