徠卡熒光顯微鏡

徠卡熒光顯微鏡

徠卡熒光顯微鏡

：李小兵

在熒光顯微鏡的基本原理是細(xì)胞成分有熒光劑的幫助的非常具體的可視化。這可以是熒光蛋白 - 例如綠色熒光蛋白 - 基因與感興趣的蛋白質(zhì)。如果克隆是不可能的 - 例如組織學(xué)標(biāo)本中 - 這是需要使用其他技術(shù)，如免疫熒光染色來可視化目的蛋白質(zhì)。用于此目的的抗體的利用，這是可以直接或間接地連接到不同的熒光染料和結(jié)合到適當(dāng)?shù)哪繕?biāo)結(jié)構(gòu)。此外，與熒光染料的徠卡熒光顯微鏡的幫助下，不于蛋白，但它也提供了機(jī)會(huì)染色核酸，多糖和其他結(jié)構(gòu)?？梢詸z測(cè)甚非生物物質(zhì)，如鈣離子。本文介紹了常用的熒光劑。

熒光免疫

在熒光顯微鏡有兩種方式來可視化你的目標(biāo)蛋白。無論是與一個(gè)固有熒光信號(hào)的幫助下 - 這意味著通過克隆，因此基因連接的熒光蛋白與靶蛋白?；蚪柚鸁晒鈽?biāo)記的特異性結(jié)合到感興趣的蛋白質(zhì)的抗體。對(duì)于一些生物的問題是比較有用的，甚需要進(jìn)行后者。在組織學(xué)樣品的情況下，例如，它不可能使用的，因?yàn)樵谝话愕臉悠繁粡钠渲胁怀钟腥魏螣晒獾鞍椎纳飦碓吹臒晒獾鞍?。此外，如果一個(gè)有效的抗體可用，免疫比熒光蛋白技術(shù)快得多，是你要克隆的興趣和轉(zhuǎn)染的DNA的基因插入到適當(dāng)?shù)募?xì)胞。熒光蛋白的另一個(gè)缺點(diǎn)在于身為蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)。有了它，它們具有可導(dǎo)致功能障礙或誤解關(guān)于感興趣的附著蛋白的細(xì)胞內(nèi)特定蛋白質(zhì)性的特點(diǎn)。然而，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為，使用熒光蛋白是通常選擇的方法來觀察活細(xì)胞。 

免疫熒光法利用抗體與其抗原的非常特異性結(jié)合親和力的。這可以有兩種不同的外觀。簡(jiǎn)單的方法是使用一種被結(jié)合到感興趣的蛋白的熒光標(biāo)記的抗體。這就是所謂的直接免疫熒光。 

在大多數(shù)情況下，有兩種形式的抗體的使用。*個(gè)結(jié)合靶蛋白并沒有熒光標(biāo)記本身（*抗體）。但是，第二個(gè)（第二抗體），其結(jié)合*抗體特異性帶有熒光染料。這種方法被稱為間接免疫熒光和具有若干優(yōu)點(diǎn)。一方面有一個(gè)放大的效果，因?yàn)槎嘤谝粋€(gè)的第二抗體結(jié)合于一個(gè)*抗體。另一方面，沒有必要所有的時(shí)間標(biāo)記每個(gè)抗體對(duì)您喜歡的蛋白與熒光染料而使用的商業(yè)熒光標(biāo)記的第二抗體。廣泛使用的熒光染料的免疫是FITC，TRITC或都提到了以下幾個(gè)Alexa的Fluor?染料。

FITC 和TRITC

異硫氰酸熒光素（FITC）是有機(jī)熒光染料仍然在免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)使用。它的激發(fā)/發(fā)射峰在517分之495nm和可耦合到不同的抗體，其反應(yīng)性異硫氰酸酯基，其上結(jié)合的蛋白質(zhì)的氨基，巰基，咪唑基，酪氨?；螋驶膸椭?。它的基本形式 - 熒光素 - 具有332克/摩爾的摩爾質(zhì)量，并經(jīng)常被用來作為熒光示蹤劑。 FITC（388克/摩爾），這是用于熒光顯微鏡和服務(wù)為原點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的熒光染料類的AlexaFluor?488*的染料之一。其熒光活性是由于其大的共軛芳族電子系統(tǒng)，它是由光的藍(lán)色光譜激發(fā)。

圖1：果蠅胚胎發(fā)育，綠色：FITC，紅色：TRITC       圖2：小鼠成纖維細(xì)胞，綠色F-肌動(dòng)蛋白，F(xiàn)ITC Red：Tubulin, Cy5, 藍(lán)色：細(xì)胞核，DAPI

很多時(shí)候同日而語用FITC使用的染料是它的發(fā)音相似的伙伴TRITC（四甲-5（6）-isothiocyanate）。相反，F(xiàn)ITC，TRITC不是熒光素，但羅丹明家族的衍生物。羅丹明也有一個(gè)大的共軛芳族電子系統(tǒng)，是什么導(dǎo)致了它們的熒光行為。相反，F(xiàn)ITC，TRITC（478克/摩爾）為激發(fā)光在綠色光譜，大在550nm處。其大發(fā)射是在撒謊，在573納米。鍵合到蛋白質(zhì)（如抗體）也基于反應(yīng)性異硫氰酸酯基團(tuán)。 

即使FITC和TRITC仍然在使用，它們是相當(dāng)弱的熒光染料和不*用于本域顯微鏡的狀態(tài)。他們的利潤(rùn)是根據(jù)自己的經(jīng)濟(jì)代價(jià)。

花青

這種相對(duì)小集合熒光染料是來自菁這也是起源于他們的名字的Cy2，Cy3，Cy5和Cy7標(biāo)記。所有的人都可以通過它們的反應(yīng)性基團(tuán)被連接到核酸或蛋白質(zhì)。對(duì)于蛋白質(zhì)性標(biāo)簽使用的馬來酰亞胺基團(tuán)，例如。有趣的 - 有關(guān)熒光 - Cy5的是其電子周圍敏感。這可以用于酶測(cè)定。的附連蛋白導(dǎo)致正的或負(fù)的變化中的熒光發(fā)射的構(gòu)象變化。此外Cy3和Cy5可用于FRET實(shí)驗(yàn)?；ㄇ嗳玖鲜潜容^老的熒光染料和依據(jù)其他熒光染料具有改進(jìn)的亮度，耐光性，量子產(chǎn)率等。

Alexa Fluor?染料

Alexa Fluor?染料這是經(jīng)常使用的熒光顯微鏡一大群的帶負(fù)電荷的親水性和熒光染料。他們的稱謂可追溯到它的理查德·保羅·豪格蘭誰任命他的兒子亞歷克斯畢浩然后的染料。該標(biāo)簽是分子探針（生命技術(shù)的附屬公司）的注冊(cè)商標(biāo)。此外，各激光的激發(fā)波長(zhǎng)中提到他們的標(biāo)簽。例如在非常廣泛使用的AlexaFluor?488具有大激發(fā)，在493納米，它允許勵(lì)磁用標(biāo)準(zhǔn)488nm的激光。 Alexa Fluor?488具有發(fā)射大值在519納米。與此特征，Alexa Fluor?488具有非常相似的性質(zhì)，以FITC。雖然Alexa Fluor?488是熒光素衍生物，而相比之下，F(xiàn)ITC它具有更好的穩(wěn)定性，亮度和較低的pH敏感性。所有的AlexaFluor?染料是不同的基本的熒光物質(zhì)如熒光素，香豆素類，花青或羅丹明（如Alexa Fluor?546，Alexa Fluor?633）的磺化形式。它們的摩爾質(zhì)量范圍為4101400克/摩爾。

圖3：轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎，interlimb體節(jié)，在10.5天的轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎的五interlimb體節(jié)：EpaxialMyf5綠色熒光蛋白;免疫染色的GFP-Alexa的488;沾上結(jié)蛋白，Cy3的胚胎肌纖維，細(xì)胞核被發(fā)現(xiàn)用Hoechst大小從上到下：3.5毫米（一），800微米（B）。奧莉喬瑞，Cellules Souches與發(fā)展協(xié)會(huì)，巴斯德研究所，法巴黎和IGBMC，IGBMC成像中心：禮貌

圖4：小鼠成纖維細(xì)胞，綠色F-肌動(dòng)蛋白，F(xiàn)ITC紅：微管蛋白，Cy5 ，藍(lán)色：細(xì)胞核的DAPI。君特·吉斯博士，馬普醫(yī)學(xué)研究所，德海德堡：禮貌

DNA染色

在熒光顯微鏡不僅蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的利益，也有核酸。有時(shí)有必要通過其核的檢測(cè)，以確定細(xì)胞的確切位置或數(shù)量。一種常見的DNA污斑是DAPI（4'，6 - 二脒-2 - 苯基吲哚），其結(jié)合在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的豐富的區(qū)域。 DAPI熒光強(qiáng)度增加，如果附著的DNA相比，其未綁定狀態(tài)。據(jù)興奮紫外光，大的358納米。發(fā)射譜很廣，在461 nm的峰值。弱熒光，也可用于RNA結(jié)合檢測(cè)。在這種情況下，發(fā)射偏移到500nm。有趣的是，DAPI是能夠滲透完整的細(xì)胞膜。因此，它可以在固定，以及在活體細(xì)胞中。 

第二個(gè)廣泛使用的DNA染色方法是染料Hoechst公司，它初是由化工企業(yè)赫斯特公司的家庭。赫斯特33258，赫斯特33342，和赫斯特34580頃雙 - benzimides與嵌入傾向的AT豐富的地區(qū)，于是后者不使用非常頻繁。類似DAPI它們通過紫外光激發(fā)而具有發(fā)射大值在455納米，它被移動(dòng)到510-540毫微米以未結(jié)合狀態(tài)。 Hoechst的污漬也被細(xì)胞滲透性，可以在固定和活細(xì)胞，因此可以使用。的差異，以DAPI是其較低的毒性。

一種膜防滲的DNA染色是丙啶，碘化物。它，它通常用于在細(xì)胞培養(yǎng)活細(xì)胞和死細(xì)胞之間進(jìn)行區(qū)分，因?yàn)樗荒芾鲜沁M(jìn)入完整細(xì)胞。 Propidium-碘化物也嵌入劑，但沒有約束力的偏好不同的堿基。在核酸結(jié)合的狀態(tài)下，其大激發(fā)是在538納米。高排放為617納米。未綁定丙啶，碘激發(fā)和發(fā)射大值被移到較低的波長(zhǎng)和強(qiáng)度較低。它也可以結(jié)合RNA，而不改變它的熒光特性。區(qū)分的RNA的DNA，需要使用適當(dāng)?shù)暮怂崦浮?nbsp;

染料，其能夠使以前無操縱的DNA和RNA之間的差是吖啶橙。它的激發(fā)/發(fā)射大對(duì)在DNA版502納米/525納米和轉(zhuǎn)向460納米/650納米的綁定RNA的狀態(tài)。此外，它能夠進(jìn)入酸性隔室等溶酶體。有陽離子染料被質(zhì)子化。在此酸性吖啶橙周圍被光在藍(lán)色光譜激發(fā)的，而發(fā)射是強(qiáng)的橙色區(qū)域。由于細(xì)胞凋亡有很多吞沒酸性車廂這使得它經(jīng)常被用來標(biāo)記那些類型的細(xì)胞。

艙和細(xì)胞器的特定染料

圖5：Pukinje細(xì)胞，小鼠小腦皮質(zhì)的三重標(biāo)記矢狀竇旁一節(jié)。紅色：抗鈣結(jié)合蛋白-D28K/ Cy3的，綠色環(huán)保：抗GFAP/ Cy5的，藍(lán)色：赫斯特33258

圖6：牛肺血管內(nèi)皮細(xì)胞。紅色：線粒體標(biāo)記MitoTracker?紅CMXRos，綠色F-肌動(dòng)蛋白標(biāo)記的綠色熒光BODIPY?FL phallacidin，藍(lán)色：DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核。使用3D盲解卷積此圖像增強(qiáng)

在熒光顯微鏡中是經(jīng)常合理染色細(xì)胞區(qū)室像溶酶體或內(nèi)體和細(xì)胞器像線粒體。為此，有將在本節(jié)中提到的具體可用染料的調(diào)色板。

一種公知的方法來觀察線粒體是MitoTracker?的利用率。這是一種細(xì)胞滲透性染料有輕微巰基反應(yīng)性氯部分。有了它，就可以通過共價(jià)鍵與半胱氨酸殘基的游離巰基反應(yīng)結(jié)合到基質(zhì)蛋白。 MitoTracker?存在以不同的顏色和修改（第表1）和是Molecular Probes公司的一個(gè)注冊(cè)商標(biāo)。相反，如羅丹明123或tetramethylrosamine傳統(tǒng)線粒體特定污漬，MitoTracker?不破壞膜電位與固定劑后沖了出去。

根據(jù)線粒體的污漬也有染料標(biāo)記的酸性區(qū)室像溶酶體被稱為L(zhǎng)ysoTracker。這些都是鏈接到熒光膜滲透性弱堿性。很可能這些堿有，因?yàn)橘|(zhì)子的酸性區(qū)室的親和力。 LysoTrackers也以不同的顏色（S表1）可用。

一個(gè)可比較艙溶酶體是像釀酒酵母真菌液泡。此膜的封閉空間是酸性性質(zhì)也?？梢暬跓晒怙@微鏡中的一種方法是使用苯乙烯基染料等調(diào)頻4-64?或FM5-95?。

當(dāng)涉及到蛋白分泌實(shí)驗(yàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）是一種特殊的興趣。一個(gè)經(jīng)典的染料來染色這個(gè)車廂是DiOC6（3）。它有一個(gè)偏好的急診室，但仍綁定到其他膜像線粒體。另一種方法特異性染色質(zhì)網(wǎng)是用ER-跟蹤器一樣ER-跟蹤綠色和紅色。兩者都是它們與格列本脲腎上腺素類染料 - 一個(gè)sulfonylurease - 它結(jié)合到ATP敏感性鉀通道的*駐留在ER膜。 BODIPY（硼 - 二吡咯亞甲基）描述了一組相對(duì)pH值不敏感的染料幾乎都是水不溶性的。這并沒有使他們的蛋白質(zhì)標(biāo)記，但脂質(zhì)和膜標(biāo)簽的一個(gè)很好的工具。

相鄰的車廂內(nèi)質(zhì)網(wǎng) - 高爾基appararatus - 可以用熒光神經(jīng)酰胺類似物如NBD C6-神經(jīng)酰胺和BODIPY FL C5-神經(jīng)酰胺。神經(jīng)酰胺是鞘脂的高度富集于高爾基體。

隨著進(jìn)一步基于脂質(zhì)染料的幫助有可能弄臟特殊膜區(qū)域樣脂質(zhì)筏。這些富含膽固醇的結(jié)構(gòu)域可以通過使用NBD-6膽固醇或NBP-12膽固醇除其他（Avanti極性脂質(zhì)）被可視化。 

除了使用特殊的非proteinacous熒光染料標(biāo)記的細(xì)胞區(qū)室，也可以染色的與蛋白質(zhì)的幫助下與偏好在小區(qū)的不同位置感興趣的區(qū)域。這些蛋白質(zhì)可以被鏈接到的熒光染料和可視化的熒光顯微鏡。一個(gè)示例為這樣一種方法是麥胚凝集素（WGA）的用法，其特異性地結(jié)合于唾液酸和N-乙酰葡糖氨基存在于質(zhì)膜上。 WGA被耦合到熒光染料。與之質(zhì)膜可以被觀察到。

離子成像

在神經(jīng)元的研究中，基因的活性或細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的情況下 - 例如 - 它是感興趣了解的細(xì)胞中的離子濃度。鈉，鈣，氯離子或鎂離子具有在許多不同的細(xì)胞事件的深刻影響。通常，離子可被捕獲與熒光標(biāo)記的螯合劑，當(dāng)綁定到適當(dāng)?shù)碾x子而改變它們的光譜性質(zhì)的幫助。這個(gè)原理體現(xiàn)在鈣指標(biāo)呋喃-2，吲-1，熒光 - 3，熒光4和鈣綠，例如。 

鈉檢測(cè)，SBFI（鈉結(jié)合benzofurzanisophthalate）或綠色鈉是常用的。 PBFI（鉀結(jié)合苯并呋喃間苯二甲酸）檢測(cè)鉀離子。 

有趣的是也有基于蛋白質(zhì)的鈣指標(biāo)。其中之一是基于化學(xué)發(fā)光的水母蛋白水母發(fā)光蛋白。水母發(fā)光蛋白的發(fā)光團(tuán)腔腸素，分子氧和Ca2 +的相互作用導(dǎo)致了藍(lán)色的光的 - 在熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)非常突出的機(jī)構(gòu)。