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NGS測序技術(shù)近年來得到了巨大發(fā)展，2017年摩根大會上，Illumina重磅推出NovaSeq測序儀，NovaSeq可以2天產(chǎn)生2Tb數(shù)據(jù)，通量是10年前Genome Analyzer的2000倍。測序通量的大幅增加，意味著更多的樣本混合上機，這樣的話我們?nèi)绾卧诿Ｃ?shù)據(jù)中找到對應(yīng)樣本匹配的數(shù)據(jù)呢？人們想到了一種在文庫構(gòu)建時在接頭上添加“接頭暗號"的方法，在測序完成之后根據(jù)“接頭暗號"對樣本進(jìn)行分離。這里的接頭暗號就是樣本標(biāo)簽“Index/Barcode"。本文將以建庫過程中要添加的接頭為核心，對其進(jìn)行全面介紹。
1.接頭是什么？
接頭的本質(zhì)是一段短的堿基序列，基本包括三個部分：與flow-cell上面寡核苷酸相同或互補的片段P5/P7；測序時測序引物結(jié)合部分R1/R2；用于區(qū)分不同樣本的Index。接頭是待測DNA片段與Flow-cell連接的橋梁，目的片段連接接頭后可以在flow cell上擴增再測序。
圖1.兩端添加接頭的DNA片段
2.接頭如何分類？
接頭的分類方法主要有兩種，一是按照Index的位置，二是按照是否匹配PCR free建庫。
（1）根據(jù)Index位置可以將接頭分為單端Index接頭和雙端Index接頭。單端Index接頭指的是僅在P5端或P7端存在Index（一般在P7端），雙端Index接頭指的在P5和P7端均存在Index。（如圖2所示）。Index的數(shù)目直接影響最終上機能混合的樣本數(shù)目，雙端Index具有比單端Index能容納更多數(shù)目的樣本，近年來為了滿足一次能測量更多的樣本的需求，雙端帶Index的接頭被廣泛使用。
圖2：接頭按照Index位置分為單端Index接頭和雙端Index接頭，兩種接頭連接后示意圖
（2）根據(jù)接頭是否匹配PCR free建庫可以將接頭分為長接頭和短接頭（見圖3）。長接頭又稱為完整接頭，包括P5/P7+Index序列+Read 1/2，完整接頭通過TA克隆的方式連接到DNA片段之后，可不進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)直接上機測序（DNA量足夠上機測序時可直接上機，當(dāng)DNA量不夠時還需進(jìn)行PCR擴增使得產(chǎn)物達(dá)到一定的量方可上機測序）。短接頭通過TA克隆方式連接到DNA片段上后，必須與短接頭互補的引物進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物就是包含完整接頭的DNA片段（見圖4）。也就是說短接頭最終一定要通過PCR擴增成為完整接頭才能上機測序。
圖3：左邊為Illumina早期推出的短接頭，不包含Index；右邊為長接頭，是Illumina目前標(biāo)準(zhǔn)通用接頭樣式
圖4：短接頭建庫流程圖
3.Index有何奧秘？
Index作為接頭中的重要組成部分到底有著怎樣的奧秘呢？簡單來說Index就是混合樣本中不同樣本的“身份"，其本身就是一段堿基序列，一般長6nt或8nt。通過對這種“身份"的識別，就可以在混合樣本中對單個樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行識別。那么問題來了，四種堿基隨機構(gòu)成的排列組合序列那么多，這些都可以用作Index嗎？選擇Index序列的依據(jù)又是什么呢？
Index的選擇需滿足兩個原則：堿基平衡和激光平衡
a）堿基平衡：是指Index序列的復(fù)雜度和平衡度：復(fù)雜度指的是堿基的種類的多樣；平衡度指的是堿基之間分布比例的均衡。需要注意的是堿基的平衡是指多個Index之間的平衡，而不是單個index內(nèi)部的堿基平衡。好的Index序列應(yīng)該是均含有A、T、C、G四種堿基，且各堿基之間的比例接近25%，如圖5所示。
圖5：符合堿基平衡的Index號（ATGC,TACG,GCTA,CGAT）舉例，分別符合單個Index內(nèi)部平衡和多個Index相應(yīng)堿基位的堿基平衡
b）激光平衡：是指在一組Index序列中需滿足每個堿基位A + C =G + T，在Illumina測序儀中，A和C兩種堿基共用一種激光，由波長660nm的紅激光激發(fā)；G和T共用一種激光，由波長532 nm的綠激光激發(fā)。需要說明的是激光平衡是在堿基不平衡的情況下的無奈之舉，在一定程度上可以提高index測序時的堿基識別質(zhì)量，減少數(shù)據(jù)分離時出問題的可能性，見圖6。
圖6：不符合堿基平衡但符合激光平衡的Index號（ATGC,TACG,AGAG,TCTC）舉例
如樣本數(shù)為單數(shù)，則必然無法滿足堿基平衡和激光平衡，此時可以選擇幾個縱列是互補的兩個Index，再加上一個其他的Index，可保證測序質(zhì)量。
結(jié)語
高通量測序技術(shù)的發(fā)展，使得測序的通量不斷增加，通量的增加就意味著多樣本混合上機測序。由此而來的問題是在NGS的過程中如何做到對每個樣本數(shù)據(jù)的對號入座。科學(xué)家想到給樣本一個“身份"，這樣就可以憑證識別。因此對于NGS從業(yè)者來說，在享受高通量測序帶來的方便快捷的同時，還要記得給自己的樣本戴好‘證件’哦。
