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如何定量低豐度目的基因的表達（含詳細解決方法）
有時候，qPCR實驗會成為阻礙你課題順利開展的強勢攔路虎！看似簡單的基因表達量差異驗證，當遇到低豐富表達的基因時，也許就舉步維艱。模板獲取困難導致的RNA提取量少或RNA質(zhì)量不佳，即使選蕞佳的試劑、篩選出良好的引物，也有可能qPCR定量得到的內(nèi)參基因CT值在18-20個cycle，而目的基因在31-35個循環(huán)。遇到這種情況，你是怎么解決的呢？
qPCR在低豐度表達基因定量中的局限性
基因的豐度是指基因在基因組中的拷貝數(shù)?？煞譃楦哓S度，中等豐度和低豐度。低豐度是指目的基因在基因組中的拷貝數(shù)低,可簡單認為2ng 總RNA中低于100個拷貝數(shù)的基因。從qPCR實驗結果來講，當擴增效率為100%，模板加入量在1-10ng范圍內(nèi)，qPCR得到的CT值高于28時即可認為低豐度基因,如下表所示。
對低豐度表達和超低豐度表達的基因進行qPCR實驗，會出現(xiàn)兩個難點：一是如何保證定量結果的準確性；二是如何對得到的結果進行數(shù)據(jù)分析。
如何定量好低豐度目的基因？
定量結果的準確性需要依賴定量實驗的合理設計。低豐度基因定量實驗常常出現(xiàn)以下情況：樣品復孔間重復性差（見下圖）、PCR擴增效率低不能有效反映或接近基因的實際表達量。
一、如何保證定量結果的準確性
- 保證復孔間的重復性
低拷貝基因在總RNA中的分布極不均勻，容易引起復孔間的誤差，造成重復性差。
建議：1、在保證儀器等設備校準的情況下，可以增加cDNA的稀釋倍數(shù)，增加上樣體積，減少移液誤差；
2、增加復孔數(shù)，對偏差較大的數(shù)值予以舍棄；
3、還有一種方法就是引入一種不相關的carrier DNA(or RNA), 這些物質(zhì)不跟目標基因發(fā)生反應，不干擾基因的檢測，減少移液過程中靶基因粘壁或槍頭的損耗。
- 保證引物的擴增效率
qPCR擴增效率的要求是在90-110%。理論上，每對引物均需要預實驗進行標準曲線確認擴增效率，說到底qPCR反應包含模板，引物和反應試劑，因此可從以下角度優(yōu)化擴增效率：
1、模板質(zhì)量的要求：模板純度低，含抑制劑會抑制PCR擴增，不利于qPCR實驗的進行。模板發(fā)生降解，引物無法有效退火到目標區(qū)域，也會造成擴增效率下降。高質(zhì)量的模板從來都是進行qPCR實驗的要求之一！
2、優(yōu)化引物設計：常見的引物設計原則可自行百度。非特異性擴增會競爭消耗引物和Taq酶，也會降低目標基因的擴增效率。引物二聚體可參照下一條介紹。
3、引物濃度優(yōu)化：引物濃度高，模板濃度過低，會引起引物二聚體的形成。對于低豐度基因而言，引物二聚體與SYBR Green I結合產(chǎn)生的熒光，會干擾背景值，造成試劑檢測靈敏度下降！
4、試劑的選擇：選用特異性好，檢測靈敏度高的qPCR預混液。當然，相對于二步法qPCR定量而言，選取一步法RT-qPCR無疑會有更好的靈敏度，該方法將反轉(zhuǎn)錄和qPCR置于一管，增加了檢測的靈敏度。
二、如何對定量結果進行分析
下面我們從擴增效率角度和內(nèi)參基因與目的基因△CT值的差異進行解釋低豐度基因定量數(shù)據(jù)的評判標準。
a.當內(nèi)參基因和目的基因的擴增效率一致，且擴增效率均接近100%：
1、內(nèi)參基因和目的基因的△CT值相差較大時，如內(nèi)參基因Ct值在20，目的基因Ct值在32。
當遇到以上情況，且實驗的樣本材料較或RNA純化量較少，可考慮以下分析方法。
首先構建質(zhì)粒標準品，做標準曲線，測定TNF（目的基因）和HPRT（內(nèi)參基因）擴增效率，如下表。
由上表可以看出，內(nèi)參基因與目的基因的△Ct值相差均勻，表明擴增效率接近。
當研究“Jurkat cells were untreated or treated with PMA”，TNF表達量計算如下表：
可以看出，以上數(shù)據(jù)直接按照正常的△△Ct法分析即可。該分析方法的前提是qPCR試劑可準確定量超低濃度模板量。
2、內(nèi)參基因和目的基因的△CT值相差較?。ㄟm用于樣本RNA量多時）
當選用的qPCR試劑檢測范圍較小時，對低濃度模板不能準確定量，可增加模板加入量，使內(nèi)參基因和目的基因均在試劑檢測的有效范圍。此時的關鍵在于選擇表達豐度和目的基因相近的內(nèi)參基因。內(nèi)參基因的選擇依據(jù)有二：一是不受作用因素的影響且表達量相對恒定；二是選取多個內(nèi)參基因，均一化誤差。下表列舉了常見的內(nèi)參基因，豐度從高到低，根據(jù)目的基因表達豐度選取1-3個進行對照校正。
b.內(nèi)參基因和目的基因的擴增效率不一致，但均在90%-110%之間——雙標準曲線法
利用雙標準曲線法計算基因的相對表達量。
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