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全細胞凋亡檢測攻略
近年來，隨著對凋亡研究的深入，在細胞凋亡的識別、確認及機制等方面的研究進展顯著，用于檢測細胞凋亡的新方法不斷涌現(xiàn)。細胞凋亡由基因嚴格控制，包括一系列特征性變化，如核固縮、核碎裂、凋亡小體形成等形態(tài)學變化以及DNA特征性片段化、新基因表達、某些生物大分子合成等生物化學變化。
細胞凋亡的檢測方法正是基于凋亡細胞特殊的形態(tài)學改變和生物化學變化而設(shè)計的。
細胞發(fā)生凋亡時會出現(xiàn)一系列*的形態(tài)學變化：
1） 細胞體積變小
2） 核固縮，核仁碎裂，染色質(zhì)密度增高
3） 胞質(zhì)濃縮，細胞器密度增高
4） 細胞膜皺褶、卷曲、內(nèi)陷，并將胞質(zhì)和DNA分割包裹形成凋亡小體。
圖1. 1：對照組細胞，2-6：分別用不同濃度DHA誘導凋亡后的細胞狀態(tài)[1]
細胞發(fā)生凋亡時，Ca2+、Mg2+依賴型核酸內(nèi)切酶與相關(guān)蛋白水解酶被激活，將DNA降解，形成長度為180-200bp或其整倍數(shù)的DNA片段。
活細胞DNA：不斷裂，凝膠電泳為一正常條帶
壞死細胞DNA：隨機斷裂，凝膠電泳表現(xiàn)為彌漫連續(xù)模糊的條帶
凋亡細胞DNA：等腰梯形條帶
圖2. 泳道2：正常細胞DNA；泳道6：凋亡細胞DNA
末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）可直接催化斷裂DNA的3′端的核酸聚合反應，加入帶有熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素標記的核苷酸，顯色反應后可特異地進行原位凋亡細胞的檢測。正常或增殖細胞幾乎沒有 DNA 的斷裂，故很少被染色。
圖3. YEASEN TUNEL-FITC試劑盒（點擊查看產(chǎn)品：CAT.40306）檢測凋亡細胞樣本
細胞凋亡早期， 磷脂酰絲氨酸(phosphotidylserine，PS)從細胞膜胞質(zhì)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜外表面。Annexin V可與 PS 特異性結(jié)合，用Annexin V（熒光素或生物素標記）作為熒光探針，并與PI同時使用，借助FCM分析染色情況，其中Annexin V-／PI-、Annexin V+／PI+、Annexin V+／PI-、Annexin V-／PI+分別表示正常、晚期凋亡或壞死、早期凋亡和機械性損傷的細胞。
圖4. YEASEN Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒（點擊查看產(chǎn)品:CAT.40302）檢測細胞凋亡
處于凋亡早期的細胞，在顯微鏡下還未出現(xiàn)顯著變化時，其膜電位已經(jīng)開始改變：膜通透性增加，跨膜電位下降。膜電位下降被認為是凋亡最早的步驟，如果膜電位被破壞，則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。一些親脂陽離子熒光染料，如羅丹明123、JC-1等可與線粒體基質(zhì)緊密結(jié)合，細胞聚集染料能力的下降程度與膜電位的下降程度呈正相關(guān)。
圖5. YEASEN JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒（點擊查看產(chǎn)品：CAT.40706）檢測膜電位變化[3]
細胞的生命活動都離不開 Ca2+ ，Ca2+超載時，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，細胞內(nèi)外Ca2+平衡被破壞，導致細胞凋亡。用 Ca2+特異性熒光探針，如Rhod-2、Indo-1、Fluo-4等對細胞進行標記后，再用 FCM 或熒光、共聚焦激光顯微鏡檢測，可以準確地得出細胞凋亡的生理指標。
圖6. YEASEN Fluo-4， AM，細胞膜可滲透鈣離子熒光探針（點擊查看產(chǎn)品：CAT.40704）[4]
細胞周期劃分為 G1 期、S 期、G2 期和 M 期，細胞凋亡后發(fā)生DNA斷裂，用碘化丙啶（PI）、苯基吲哚、吖啶橙等染色劑標記 DNA，通過FCM分析，可以得到細胞各時期的分布狀態(tài)，可計算出各個時期細胞的比例，以判定細胞凋亡的程度和比率。
細胞凋亡時，DNA發(fā)生核小體間的斷裂，形成由DNA與組蛋白（包含 H、H2A、H2B、H3、H4 五組分）緊密結(jié)合的核小體單位的片段。采用雙抗體（抗組蛋白抗體和抗DNA抗體）夾心免疫法檢測細胞凋亡后形成的核小體，酶催化后形成有色產(chǎn)物，根據(jù)顏色反應的深淺定性定量分析細胞的凋亡情況。
caspase-3 被認為是各種因素導致凋亡的關(guān)鍵酶，生理狀態(tài)下它以酶原的形式存在，它的活化預示著細胞執(zhí)行凋亡程序的開始，是凋亡進入不可逆階段的標志。目前，壞死細胞中尚未發(fā)現(xiàn)有caspase-3 的活化，因此，通過檢測 caspase-3 活力強弱可判斷細胞是否凋亡或壞死。
細胞凋亡時某些基因表達異常產(chǎn)物，這些基因轉(zhuǎn)錄翻譯出來的產(chǎn)物可促進或抑制細胞凋亡，如細胞凋亡蛋白家族、凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf-1）及 Fas等。這些相關(guān)基因及其表達產(chǎn)物的測定可為細胞凋亡檢測提供依據(jù)。
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒 | 40302ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
Annexin V-EGFP/PI 細胞凋亡檢測試劑盒 | 40303ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 凋亡檢測試劑盒 | 40304ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
Annexin V- Alexa Fluor 488/PI 細胞凋亡檢測試劑盒 | 40305ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（FITC） | 40306ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（Alexa Fluor 488） | 40307ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（Alexa Fluor 640） | 40308ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒 | 40310ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒 | 40706ES60 | 100T |
JC-10線粒體膜電位檢測試劑盒 | 40752ES60 | 100T |
鈣離子探針(Indo-1/ Rhod-2/Fura-2/Fluo-3/Fluo-4) | 40775/40776/40702/40703/40704 | 50ug/5*50ug/1mg |
[1]李媛媛, 吳洪娟. 雙氫qinghao素體外誘導人乳腺癌細胞凋亡的電鏡研究[J]. 電子顯微學報, 2015(02):138-141.
[2] Suman S,Pandey A, Chandna S. An improved non-enzymatic “DNA ladder assay” for more sensitive and early detection of apoptosis[J]. Cytotechnology, 2012, 64(1):9-14.
[3] Liang W L, Xiao L, Gu H W , et al. Solid lipid nanoparticle induced apoptosis of macrophages via a mitochondrial-dependent pathway in vitro and in vivo[J]. International Journal of Nanomedicine,2019,14:3283-3295.
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