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核酸檢測用到的核心酶原料，您了解嗎？

2022-4-25　　閱讀(1545)

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核酸檢測用到的核心酶原料，您了解嗎？


2022年3月以來，狡猾的奧密克戎變異毒株又一次打破了人們平靜的生活，全國各地陸續(xù)爆發(fā)疫情，波及30個?。▍^(qū)、市）。核酸檢測作為疫情精準(zhǔn)防控的有效手段，儼然已成為一種生活常態(tài)，“今天你核酸了嗎？"也轉(zhuǎn)變?yōu)槿藗兊娜粘柡蛘Z。說到這，大家了解核酸檢測中需要用到哪些核心原料嗎？本文就來介紹一下核酸檢測中最關(guān)鍵的核心原料-酶。

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圖片來源：攝圖網(wǎng)


核酸檢測流程


酶是一類極為重要的生物催化劑，具有催化高效性和反應(yīng)特異性。絕大多數(shù)生化反應(yīng)均需要酶的參與，核酸檢測也不例外。在核酸檢測過程中（圖1所示），不同類型的分子酶在核酸檢測的不同實驗階段（核酸提取、RT-qPCR）發(fā)揮了重要的作用。

接下來，小翌根據(jù)核酸檢測中的不同實驗環(huán)節(jié)為大家梳理核酸檢測過程中用到的核心酶原料。
 
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圖1.核酸檢測流程


01
核酸提取過程中的核心酶


核酸提取過程主要包括裂解和純化兩大步驟：裂解是破壞樣品細胞結(jié)構(gòu)，從而使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程；純化則是使核酸與裂解體系中的其它成分，如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)*分離，反應(yīng)過程需要蛋白酶K（Proteinase K）、脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase I）及RNase抑制劑的參與。

1

蛋白酶K


蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶，可切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵（圖2所示）。在核酸提取過程中，蛋白酶K可降解與核酸緊密結(jié)合的組蛋白，促進核酸的分離，使樣本核酸能更好的被提取。另外，蛋白酶K可降解RNA水解酶（RNase）活性，抑制RNase水解模板RNA。
 
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圖2.蛋白酶K水解肽鍵示意圖


翌圣生物蛋白酶K（Cat#10401ES）來源于基因重組酵母菌株，比活性≥30 U/mg蛋白，不含RNase和DNase，在尿素和SDS溶液中酶活性穩(wěn)定存在，在較廣的pH范圍內(nèi)（pH 4.0~12.0）均有活性，適用于原位雜交樣本制備，核酸純化等實驗中蛋白質(zhì)的切割清除。
 

2

脫氧核糖核酸酶Ⅰ


脫氧核糖核酸酶I（Deoxyribonuclease I, DNase I）可催化多種形式DNA，靶向切割鄰近嘧啶的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生5’端為磷酸基團、3’端為羥基的多聚核苷酸，平均消化產(chǎn)物最小為多聚四核苷酸。在核酸提取過程中，DNase I主要用于除去RNA樣本中的基因組污染，避免RNA模板中存在DNA殘留，提高模板純度。


翌圣生物DNase I（Cat#10325ES）來源于重組E. coli菌株，不含RNase，可以用于各種RNA樣品的處理，最佳的工作pH范圍是7-8。在Mg2+存在下，DNase I可隨機剪切雙鏈DNA的任意位點；而在Mn2+存在的條件下，DNase I可在同一位點剪切DNA雙鏈，形成平末端或有1-2個核苷酸突出的粘末端（圖3所示）。

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圖3.DNase I在Mg2+以及Mn2+存在下可切割dsDNA原理圖


3

RNase抑制劑


在核酸檢測過程中，樣本核酸的提取、純化或?qū)嶒灥姆磻?yīng)體系配制的過程中，均有可能引入核糖核酸酶（RNase）的污染，導(dǎo)致RNA模板被降解。若要避免RNase的污染，則需要RNase 抑制劑（RNase Inhibitor）發(fā)揮作用。


RNase Inhibitor是人的胎盤中存在的一種特異性RNase抑制劑，能夠特異地與RNase以非共價鍵結(jié)合形成復(fù)合體從而使RNase失活。翌圣生物鼠源RNase抑制劑Murine RNase Inhibitor（Cat#10603ES）不含人源蛋白中的兩個對氧化非常敏感的半胱氨酸，具有更高的抗氧化活性，能夠廣泛抑制各種類型RNase(RNase A, B, C)，更加適合于對高二硫蘇糖醇（DTT）敏感性的實驗如qPCR反應(yīng)。


02
RT-qPCR過程中的核心酶


在完成樣本核酸提取后，可通過RT-qPCR來完成核酸的檢測。在這些實驗過程中，DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶都是的核心酶原料。


1

逆轉(zhuǎn)錄酶


提取純化后RNA，在進行qPCR反應(yīng)前需先通過逆轉(zhuǎn)錄酶催化dNTP聚合（即RT-Reverse Transcription，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），生成與模板RNA互補的cDNA序列（圖4）。對于RT-qPCR反應(yīng)，應(yīng)選擇可耐高溫的逆轉(zhuǎn)錄酶，目前市面上應(yīng)用*泛的為MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，因其缺乏DNA內(nèi)切酶活性且RNase H活性較低，在cDNA克隆應(yīng)用中更有優(yōu)勢。
 
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圖4.逆轉(zhuǎn)錄過程示意圖


翌圣生物Hifair® V Reverse Transcriptase 第五代耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶（Cat#11300ES）是通過基因工程技術(shù)得到的全新逆轉(zhuǎn)錄酶，熱穩(wěn)定性好，可耐受高達60℃的反應(yīng)溫度，適合具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄。同時，該酶增強了與模板的親和力，適合少量模板以及低拷貝基因的逆轉(zhuǎn)錄，可擴增長達10 kb的cDNA。


2

DNA聚合酶


完成模板逆轉(zhuǎn)錄過程生成雙鏈cDNA以后，就需要PCR反應(yīng)中的“靈魂選手"DNA聚合酶閃亮登場，通過聚合游離的脫氧核糖核苷酸進行DNA鏈的延伸，在體外完成模板DNA的大量擴增，實現(xiàn)病毒核酸可被檢測的目的。


在RT-qPCR反應(yīng)中常用的DNA聚合酶為熱啟動Taq DNA聚合酶，該類酶在常溫條件下無活性，只有經(jīng)過熱啟動以后才具有聚合活性，可以最大限度地減少背景信號的生成，很好的解決了常規(guī)PCR反應(yīng)中引物二聚體產(chǎn)生或錯配引起的非特異性擴增等問題。目前市面上常用的DNA聚合酶熱啟動修飾方法主要有化學(xué)修飾、配體修飾和抗體修飾等，不同的熱啟動修飾方法原理如圖5所示。
 
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圖5.不同類型修飾熱啟動酶原理圖


翌圣Hieff UNICON® Hotstart High Specific Taq DNA Polymerase, 5 U/μL（Cat#10726ES）是雙抗體進行雙封閉的熱啟動DNA聚合酶，具有高模板親和力。在常溫下不僅封閉了5'→3'聚合酶活性，同時也封閉了5'→3'核酸外切酶活性。在95℃條件下變性30sec其封閉抗體即可*失活，釋放出DNA聚合酶活性和核酸外切酶活性。雙封閉特性不僅能有效防止錯配或引物二聚體引起的非特異性擴增，又能有效抑制探針降解產(chǎn)生的熒光信號下降，雙重保障使體外檢測試劑在運輸或室溫使用過程中更加穩(wěn)定。


3

尿嘧啶DNA糖基化酶


在核酸檢測過程中，操作環(huán)境中的氣溶膠污染是造成PCR結(jié)果假陽性最常見的因素，在擴增體系中加入UDG酶（Uracil DNA Glycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶）則可有效消除PCR體系中混入的擴增殘留污染物（多以氣溶膠形式存在），保證擴增結(jié)果的準(zhǔn)確性。UDG酶防污染原理如圖6所示。
 
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圖6.UDG酶防污染原理示意圖 


翌圣生物熱敏UDG酶（Cat#10303ES）在25-37℃發(fā)揮活性，熱敏感，50℃ 10 min或95℃ 2 min即發(fā)生不可逆滅活。無核酸內(nèi)外切酶和RNase殘留，宿主菌基因組殘留低于10拷貝，與熱啟動Taq DNA聚合酶搭配使用，可保證擴增反應(yīng)的特異性。


翌圣生物-核酸檢測-核心酶匯總


流程

描述

產(chǎn)品名稱

貨號

樣本處理

蛋白消化

Proteinase K

10401ES

RNA提取

Recombinant DNase I (RNase-free)

10325ES

RNase抑制

Murine RNase Inhibitor (40U/μL)

10603ES

逆轉(zhuǎn)錄

適合RT-qPCR

Hifair® V Reverse Transcriptase (200U/μL)

11300ES

Hifair® V Reverse Transcriptase (600U/μL) GLyceroL-free

11301ES

PCR擴增

熱啟動DNA聚合酶

Hieff UNICON® Hotstart High Specific Taq DNA Polymerase, 5 U/μL

10726ES

熱敏型UDG

Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG), heat-labile,1U/μL

10303ES

 
大家總說，如今的幸福標(biāo)準(zhǔn)是核酸-陰著、健康碼-綠著、臉上-笑著。我們相信，疫情終會過去，讓我們?yōu)樵缛諔?zhàn)勝疫情，共享美好時光而努力吧！



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