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抗體捕獲神器，輕松搞定IP/COIP
——Protein A /G 瓊脂糖或磁珠
Protein A、Protein G是最常應(yīng)用于抗體親和純化和免疫沉淀的蛋白。 Protein A/G瓊脂糖或磁珠將Protein A、G共價(jià)偶聯(lián)到介質(zhì)表面，具有結(jié)合能力更強(qiáng)、結(jié)合范圍更廣、實(shí)用性更高的特點(diǎn)。
Protein A/G 4FF Agarose | Protein A/G MagBeads | |
基質(zhì) | 高度交聯(lián)4%瓊脂糖微球 | 聚合物磁性微球 |
填料粒徑 | 45-165 µm | 1 µm |
載量 | >20 mg 人IgG/mL | >50 µg 人IgG/mg |
優(yōu)勢(shì) | 簡(jiǎn)單易用，無(wú)需輔助設(shè)備 | 操作簡(jiǎn)單 |
孔徑大，結(jié)合力強(qiáng) | 直徑小，動(dòng)力學(xué)好 | |
靶蛋白獲取量高 | 表面光滑，beads吸附很少，背景低，抗體消耗少 | |
缺點(diǎn) | 多孔易吸附（需要做pre-clear) | 配套磁力架使用方便 |
1、純化抗體：一步純化即可從血清或腹水樣品中分離出高純度的抗體。
2、免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）：通過(guò)對(duì)某蛋白質(zhì)的富集，研究該蛋白的特性（如翻譯后修飾等）。
3、免疫共沉淀Co-IP(co-Immunoprecipitation)：通過(guò)對(duì)某蛋白質(zhì)的富集，研究與其結(jié)合的其他蛋白（即蛋白-蛋白相互作用、蛋白復(fù)合物等）。
1、Protein A/G 4FF Agarose純化兔血清中的抗體。
圖1 Protein A/G 4FF Agarose純化抗體結(jié)果電泳圖
2、整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，為了進(jìn)一步闡明Atuveciclib在IL-1b誘導(dǎo)的基質(zhì)降解中的作用。研究人員在IL-1b刺激30 min前，先利用Atuveciclib預(yù)處理人和大鼠NP細(xì)胞2h，然后使用針對(duì)p65和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶9（CDK9）的特異性抗體對(duì)提取的總細(xì)胞蛋白進(jìn)行免疫沉淀分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， IL-1b刺激增強(qiáng)了p65和CDK9之間的相互作用，而Atuveciclib減弱了這種作用。
Fig 2. Immunoprecipitants were then subjected to western blot analysis using specific antibodies against CDK9 and p65.
1、Co-IP背景較深或者條帶雜亂
● 固相基質(zhì)的非特異性結(jié)合
● 抗體結(jié)合非特異的蛋白
● 洗滌不當(dāng)造成雜帶
● 建議方案：pre clear或者更換磁珠；設(shè)置對(duì)照排除非特異性條帶；優(yōu)化緩沖液
2、Input條帶清晰，co-IP條帶很弱？
設(shè)X為誘餌蛋白，Y為靶蛋白，有可能為
● X和Y的相互作用本身比較弱
● X蛋白并不是Y的，只部分Y與X互作
● 可以嘗試反向拉，比如用Y去拉X，可能效果比較好
3、我的蛋白正好和抗體重鏈分子量接近，要如何減少抗體干擾？
● IP/WB一抗使用不同種屬來(lái)源，選擇與IP抗體種屬無(wú)交叉反應(yīng)的二抗(Cross Adsorbed secondary antibody)
● 特殊二抗：比如僅識(shí)別重鏈或者輕鏈的二抗，或者僅識(shí)別天然抗體的二抗
● 直接源頭遏制：將抗體直接交聯(lián)到bead上，或者將抗體交聯(lián)到protein A/G上，避免洗脫干擾
4、靶蛋白沒(méi)有條帶
● 裂解液不合適，或者沒(méi)有添加抑制劑，導(dǎo)致靶蛋白或者餌蛋白構(gòu)象改變不能結(jié)合或者降解
● 餌蛋白較難洗脫，換成高強(qiáng)度的洗脫緩沖液
● 選用的抗體不合適，建議IP驗(yàn)證過(guò)的抗體，并優(yōu)化下抗體用量
● 蛋白間為弱相互作用，或者相互作用依賴翻譯后修飾
5、瓊脂糖難離心，每次總會(huì)吸上來(lái)一點(diǎn)兒
● 使用帶濾膜的離心柱，下部有接樣管，瓊脂糖*截留在濾膜上
● 換成磁珠
6、我的目的蛋白因?yàn)闆](méi)有對(duì)應(yīng)的特異性抗體而無(wú)法進(jìn)行免疫沉淀
● 若此蛋白帶標(biāo)簽，可選擇針對(duì)此蛋白的標(biāo)簽抗體來(lái)進(jìn)行免疫沉淀。
產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格（mL） | 價(jià)格（元） |
蛋白A/G瓊脂糖純化樹脂 | 36403ES03/05/08/25/60 | 1/2/5/25/100 | 278/538/878/2886/7426 |
蛋白A/G瓊脂糖快速純化樹脂 | 36404ES08/25/60 | 5 /25 /100 | 978/3186/8726 |
蛋白A/G免疫沉淀磁珠 | 36417ES03/08 | 1/5 | 787/2937 |
產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格（mL） | 價(jià)格（元） |
蛋白A瓊脂糖純化樹脂 | 36401ES08/25/60 | 5 /25 /100 | 546/2186/7426 |
蛋白A瓊脂糖快速純化樹脂 | 36402ES08/25/60 | 5 /25 /100 | 866/2656/8856 |
蛋白A/G瓊脂糖純化樹脂 | 36403ES03/05/08/25/60 | 1/2/5/25/100 | 278/538/878/2886/7426 |
蛋白A/G瓊脂糖快速純化樹脂 | 36404ES08/25/60 | 5 /25 /100 | 978/3186/8726 |
蛋白G瓊脂糖純化樹脂 | 36405ES08/25/60 | 5 /25 /100 | 546/2186/7426 |
蛋白G瓊脂糖快速純化樹脂 | 36406ES08/25/60 | 5 /25 /100 | 978/3186/8726 |
蛋白L瓊脂糖純化樹脂 | 36407ES08/25/60 | 5 /25 /100 | 2488/9988/16488 |
蛋白L瓊脂糖快速純化樹脂 | 36408ES08/25/60 | 5 /25 /100 | 2868/13288/27688 |
蛋白A純化預(yù)裝柱，1mL | 36409ES03/08 | 1 mL/5×1 mL | 528/2218 |
蛋白A純化預(yù)裝柱，5mL | 36410ES08/25 | 5 mL/5×5 mL | 1848/6838 |
蛋白G純化預(yù)裝柱，1mL | 36413ES03/08 | 1 mL/5×1 mL | 528/2218 |
蛋白G純化預(yù)裝柱，5mL | 36414ES08/25 | 5 mL/5×5 mL | 1848/6838 |
蛋白L純化預(yù)裝柱，1mL | 36415ES03/08 | 1 mL/5×1 mL | 938/3748 |
蛋白L純化預(yù)裝柱，5mL | 36416ES08/25 | 5 mL/5×5 mL | 3528/14088 |
文獻(xiàn)引用
[1] Wang X , Yu C , Wang C , et al. Novel cyclin-dependent kinase 9 (CDK9) inhibitor with suppression of cancer stemness activity against non-small-cell lung cancer[J]. European Journal of Medicinal Chemistry, 2019, 181. IF: 5.201
[2] Zheng L, Xiang C, Li X, et al. STARD13-correlated ceRNA network-directed inhibition on YAP/TAZ activity suppresses stemness of breast cancer via co-regulating Hippo and Rho-GTPase/F-actin signaling[J]. Journal of hematology & oncology, 2018, 11(1): 72. IF：7.33
[3] Jiang S, Liu Y, Shen Z, et al. Acetylome profiling reveals extensive involvement of lysine acetylation in the conversion of muscle to meat[J]. Journal of proteomics, 2019, 205: 103412. IF：3.537
[4] Gao L, Guo Q, Li X, et al. MiR-873/PD-L1 axis regulates the stemness of breast cancer cells[J]. EBioMedicine, 2019, 41: 395-407. IF：6.68
[5] Xie Y, Peng J, Pang J, et al. Biglycan Regulates Neuroinflammation by Promoting M1 Microglial Activation in Early Brain Injury after Experimental Subarachnoid Hemorrhage[J]. Journal of neurochemistry, 2019. IF：4.26
[6] Zhao Q, Liu Y, Wang T, et al. MiR-375 inhibits the stemness of breast cancer cells by blocking the JAK2/STAT3 signaling [published online ahead of print, 2020 Jul 30]. Eur J Pharmacol. 2020;884:173359. IF: 3.263
經(jīng)典文章分享：抗體親和純化系列——抗體純化，若有選擇，必是
