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不同SNP檢測(cè)技術(shù)的原理——ARMS、KASP、TaqMan、分子信標(biāo)及HRM
SNP檢測(cè)方法眾多，大約有20多種，包括基于陣列的雜交、PCR和測(cè)序等，本文主要介紹基于PCR技術(shù)的部分基因分型方法。
ARMS PCR的全稱(chēng)是突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)PCR（Amplification Refractory Mutation System PCR），也稱(chēng)為等位基因特異性PCR（Allele-Specific PCR, AS-PCR），是基于Taq DNA聚合酶無(wú)法修復(fù)引物3’末端的單個(gè)堿基錯(cuò)配，從而使得擴(kuò)增受阻的檢測(cè)方法。
ARMS PCR將SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)在上游引物3’末端，結(jié)合Taqman探針的方法檢測(cè)熒光信號(hào)值，從而判斷野生型和突變型等位基因。換言之，我們應(yīng)用ARMS PCR對(duì)野生型和突變型等位基因進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，需要設(shè)計(jì)兩條3’端核苷酸分別對(duì)野生型和突變型特異的上游引物，以及一條通用的下游引物，一條通用的探針。在Taq DNA聚合酶作用下，與模板不能匹配的上游引物將不能形成互補(bǔ)堿基對(duì)，從而產(chǎn)生錯(cuò)配，鏈延伸反應(yīng)因3’,5’-磷酸二酯鍵形成障礙而受阻，不能進(jìn)行延伸，而與模板匹配的引物體系則可以持續(xù)延伸，由于Taq酶5’到3’外切酶活性，可將Taqman探針上的熒光基團(tuán)水解，導(dǎo)致探針上熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)的距離增大，從而使得熒光信號(hào)被儀器檢測(cè)到，最終計(jì)算出對(duì)應(yīng)的△Ct值。
圖2.ARMS-PCR檢測(cè)原理
圖3.四引物擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR檢測(cè)原理
引物探針設(shè)計(jì)
首先，針對(duì)SNP的等位基因設(shè)計(jì)兩條對(duì)應(yīng)的上游引物，引物3’末端分別位于各自的SNP位點(diǎn)上，同時(shí)引物5’端各自帶有一段的標(biāo)簽序列，而下游引物則是一條常規(guī)設(shè)計(jì)共用的引物。引物一共是三條，兩條帶有標(biāo)簽序列的分型上游及一條通用下游。其次，設(shè)計(jì)兩條與上游引物標(biāo)簽序列一致的熒光探針，探針的5’端分別標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，同時(shí)對(duì)應(yīng)于熒光探針設(shè)計(jì)各自互補(bǔ)配對(duì)的淬滅探針，并在淬滅探針的3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，探針一共是四條，兩條熒光探針和兩條淬滅探針。
在第1輪PCR擴(kuò)增中，等位基因特異引物（3'末端能配對(duì)的）就可識(shí)別特定等位基因模板，完成等位基因識(shí)別，反向通用引物也會(huì)結(jié)合并完成整個(gè)PCR過(guò)程，在此階段，熒光探針仍與其互補(bǔ)的淬滅探針結(jié)合，不會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)。從第2輪PCR擴(kuò)增開(kāi)始，產(chǎn)物中出現(xiàn)含有通用標(biāo)簽序列（tag sequence）的模板，這步之后即可把通用標(biāo)簽序列引入與SNP對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物中。隨后熒光探針與tag互補(bǔ)的DNA鏈結(jié)合而添加到PCR產(chǎn)物中，因此不再與其互補(bǔ)的淬滅探針結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)而被檢測(cè)到。
利用熒光信號(hào)檢測(cè)儀或熒光定量PCR儀（配有相應(yīng)熒光探針的檢測(cè)通道）進(jìn)行信號(hào)讀取，并用軟件采集信號(hào)判別等位基因類(lèi)型（如果進(jìn)行聚類(lèi)分析，要用到KlusterCaller或SNPviewer軟件）。
圖4.KASP法檢測(cè)原理
TaqMan探針是一種雙標(biāo)記、自淬滅的水解探針，在PCR反應(yīng)中加入兩條兩端帶有不同熒光標(biāo)記的特異探針來(lái)識(shí)別不同的等位基因。其5’和3’末端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，在探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)兩者距離較近，熒光基團(tuán)的信號(hào)可被淬滅。而在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，若TaqMan探針與靶標(biāo)序列匹配，探針則可結(jié)合在DNA模板上，此時(shí)Taq酶延伸至探針位置時(shí)，其外切酶活性將切割水解探針，釋放熒光基團(tuán)，使得熒光信號(hào)增強(qiáng)。而且，隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增多，熒光信號(hào)越來(lái)越強(qiáng)，從而可通過(guò)儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化過(guò)程。
由于MGB探針的長(zhǎng)度可以設(shè)計(jì)得更短（短至13個(gè)堿基），有利于提高探針的識(shí)別特異性，因此用于檢測(cè)SNP的TaqMan探針常用MGB修飾，在TaqMan探針的3’端結(jié)合小溝結(jié)合物（minor groove binder，MGB），MGB與DNA螺旋的小溝（minor groove）契合，通過(guò)穩(wěn)定DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)來(lái)提高雜交的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。另外MGB探針包括一個(gè)不發(fā)光的淬滅基團(tuán)（NFQ），能夠真正消除傳統(tǒng)淬滅基團(tuán)產(chǎn)生的背景熒光信號(hào)，提高信噪比，提高檢測(cè)靈敏度。
圖5 TaqMan探針?lè)z測(cè)原理
分子信標(biāo)是一段雙標(biāo)記的寡核苷酸探針，其5’末端和3’末端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，且探針5’端和3’端的部分堿基可互補(bǔ)配對(duì)，從而形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使得熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)相互靠近而熒光信號(hào)較低。分子信標(biāo)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)部分包含SNP檢測(cè)位點(diǎn)，當(dāng)模板與分子信標(biāo)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的核酸序列匹配時(shí)，分子信標(biāo)可與模板雜交形成伸展?fàn)顟B(tài)，從而導(dǎo)致熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的空間距離拉大，熒光信號(hào)增強(qiáng)，因此可被儀器檢測(cè)，并確定SNP位點(diǎn)。使用不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的分子信標(biāo)，則可區(qū)分SNP類(lèi)型。
圖6.分子信標(biāo)法檢測(cè)原理
分子信標(biāo)法與TaqMan探針?lè)?lèi)似，均是通過(guò)探針中單個(gè)堿基的識(shí)別能力區(qū)分SNP，只是分子信標(biāo)采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)，而TaqMan探針使用MGB修飾，以提高探針對(duì)SNP的識(shí)別特異性。該方法本底低，特異性高，靈敏性高，不必與未反應(yīng)的探針?lè)蛛x即可檢測(cè)，可用于活體分析；但是探針合成時(shí)標(biāo)記較復(fù)雜，設(shè)計(jì)難度大。在進(jìn)行分子信標(biāo)的研究和應(yīng)用時(shí),莖干區(qū)和環(huán)狀區(qū)的序列設(shè)計(jì)是關(guān)鍵所在，這種設(shè)計(jì)不僅決定了其構(gòu)象，使在雜交后淬滅基團(tuán)與熒光基團(tuán)之間的距離達(dá)到足夠大，而且決定了其合適的使用溫度。其次，環(huán)境pH值、純度也是影響分子信標(biāo)的重要因素，pH值過(guò)高，分子信標(biāo)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)可能被破壞，出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。
PCR擴(kuò)增的熔解曲線取決于其擴(kuò)增序列，序列中一個(gè)堿基的突變都可以導(dǎo)致雙鏈DNA的解鏈溫度發(fā)生變化，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀監(jiān)測(cè)這種細(xì)微的溫度變化，可以知道擴(kuò)增的序列中是否有突變發(fā)生，從而對(duì)其進(jìn)行基因分型。
高分辨率熔解曲線（high-resolution melting analysis, HRM）是通過(guò)特定染料與擴(kuò)增特定的DNA區(qū)域，在高分辨率熔解條件下對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行溫度升降，通過(guò)熔解曲線的變化區(qū)分不同的基因型或等位基因。HRM檢測(cè)通常使用飽和熒光染料（如：LC Green、LC Green Plus、SYTO 9等），具有更強(qiáng)的DNA結(jié)合能力，且不影響PCR擴(kuò)增，在DNA解鏈過(guò)程中也不會(huì)發(fā)生重排，使得熔解曲線具有更高的分辨率。
核酸片段的固有特性，如DNA序列的長(zhǎng)度、GC含量和堿基互補(bǔ)性差異等，均能影響高分辨率熔解曲線，而結(jié)合高精度熒光定量PCR儀，其分辨精度則可達(dá)到對(duì)單個(gè)堿基差異的區(qū)分，從而可用于確定SNP位點(diǎn)。
圖7.高分辨率熔解曲線法檢測(cè)SNP結(jié)果示意圖
該方法引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，且單堿基改變、插入、缺失都能通過(guò)HRM來(lái)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，不需要探針，成本相對(duì)較低，并且可以發(fā)現(xiàn)未知突變（但不能知道具體的突變類(lèi)型）。但是HRM技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器的溫度分辨率要求相當(dāng)高，需要達(dá)到0.02~0.1℃，每升高1℃采集熒光25次，以滿(mǎn)足對(duì)單堿基差異的區(qū)分。對(duì)溫度均一性同樣要求較高，Tm的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.020-0.264℃（孔間溫度均一性要達(dá)到0.264℃以?xún)?nèi)才能保證HRM分析結(jié)果的準(zhǔn)確性），一般PCR兩孔間溫差在0.3~0.5℃，這就導(dǎo)致兩孔間最終熔解溫度相差較大，無(wú)法保證HRM分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。
翌圣生物作為上游原料企業(yè)，在分子酶領(lǐng)域深耕多年，目前已開(kāi)發(fā)了ARMS-PCR法及TaqMan探針?lè)ǖ腟NP分型檢測(cè)通用原料，已被下游廠家應(yīng)用于腫瘤伴隨診斷、藥物基因組學(xué)、單基因遺傳病、疾病易感性研究等多個(gè)領(lǐng)域。
| 產(chǎn)品名稱(chēng) | 貨號(hào) | 備注 |
| 2×Hieff Unicon® TaqMan SNP Genotyping Master Mix | 13152ES | TaqMan探針?lè)?/span> |
| 2×Hieff® Blood Direct TaqMan qPCR Master Mix(Low ROX) | 13095ES | |
| 2×Hieff Unicon® Multiplex ARMS qPCR Mix | 13755ES | ARMS-PCR法 |
| 2×Hieff Unicon® Multiplex ARMS qPCR Kit | 13229ES | |
| Hieff UNICON® HotStart Super Specific Taq DNA Polymerase | 14318ES | 單酶 |
| 10×Taq PCR Buffer(with MgCl2) | 11373ES | 通用Buffer |
通過(guò)上面SNP科普般的分享，相信大家對(duì)部分主流SNP檢測(cè)方法及特點(diǎn)有了基本的了解，那SNP主要在哪些應(yīng)用領(lǐng)域起作用，以及常見(jiàn)的SNP問(wèn)題有哪些，限于篇幅原因，敬請(qǐng)期待下篇SNP干貨分享哦！
