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克隆技術(shù)，又稱為“生物放大技術(shù)"，目前應(yīng)用泛的技術(shù)為“分子克隆"，即通過重組技術(shù)將目的DNA片段按照人們的設(shè)計定向連接起來，在特定的受體細胞中與載體同時復制并得到表達，產(chǎn)生新的遺傳性狀的技術(shù)。
大部分的分子克隆方法，諸如傳統(tǒng)分子克隆、TA克隆、Gatway克隆、TOPO克隆、無縫克隆等都繞不開目的片段制備、載體制備、連接、轉(zhuǎn)化、篩選等等步驟。經(jīng)過前幾章專題的講解分子克隆中的關(guān)鍵步驟，接下來講解分子克隆流程中的最后一步——篩選與鑒定，小翌會具體解析一下篩選與鑒定陽性轉(zhuǎn)化子的過程，為您的實驗提供好方法。
在轉(zhuǎn)化反應(yīng)的菌液中，同時包含不帶載體的感受態(tài)細胞菌株、不含目的片段的載體、目的片段、以及目的片段成功連接到載體的菌株?？赏ㄟ^抗性平板進行篩選，不含載體的菌株缺少抗生素耐受性基因，不會生長。值得注意的是，線性化載體有一定的機率自連形成環(huán)形載體，轉(zhuǎn)化后有機率獲得含有自連載體的菌株，其含有抗生素耐受性基因，菌株會在抗性平板上存活。為了獲得片段成功插入到載體上的菌株，需進行篩選和鑒定。
篩選的定義，通過一定的條件獲得含有目的片段的菌株，去除或減少不含有目的片段的菌株。具體操作為，取轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞中的菌液，涂布于有篩選條件的平板，放置在37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，生長的菌落稱為轉(zhuǎn)化子。的篩選技術(shù)是藍白斑篩選法和陽性克隆篩選法。
藍白斑篩選
藍白斑篩選法，將外源DNA克隆到含有編碼α-半乳糖苷酶功能性亞基的lacZα序列的載體中，將轉(zhuǎn)化后細胞涂布到含有l(wèi)acZ轉(zhuǎn)錄誘導子、IPTG（翌圣Cat#10902ES）、X-gal（LacZ顯色底物，翌圣Cat#10901ES）的生長培養(yǎng)基上，lacZ轉(zhuǎn)錄誘導子誘導LacZ基因表達并水解X-gal，產(chǎn)生藍色染料進而形成藍色菌落。當插入片段破壞了載體編碼的lacZα基因時，無法形成功能性LacZ，經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌落呈白色，白色菌落初步判定為載體、片段連接成功的轉(zhuǎn)化子。藍白斑篩選簡單、快速，但是不能檢測非表達型蛋白質(zhì)，且線性化載體可能被轉(zhuǎn)化，其末端“修復"并連接在一起，不會產(chǎn)生LacZα，也不會形成藍色菌落，從而出現(xiàn)假陽性等現(xiàn)象。
圖1.藍白斑篩選原理
陽性克隆篩選
陽性克隆篩選法，即在載體的MCS（多克隆位點）中含有一個對于細菌宿主致命的基因，當插入片段成功連接到MCS內(nèi)的致命基因上，可阻止其表達，從而確保只帶有插入片段的轉(zhuǎn)化細胞才能存活。
圖2.陽性克隆篩選原理
不論是使用普通的載體連接轉(zhuǎn)化后涂布于抗性平板的菌落，或是藍白斑篩選法和陽性克隆篩選技術(shù)獲得的菌落，都稱其為轉(zhuǎn)化子，而非陽性轉(zhuǎn)化子。為了進一步驗證，排除假陽性的現(xiàn)象，還需要進行鑒定，是指通過酶切、菌落PCR、測序等手段判定轉(zhuǎn)化子中是否含有目的片段，且序列一致，即可稱為陽性轉(zhuǎn)化子。
酶切
對從陽性菌落或白色菌落中提取的載體進行酶切（翌圣的FuniCut™快速限制性內(nèi)切酶Cat#15001ES-15051ES），凝膠電泳驗證，確定其條帶圖譜是否與所插入目的片段的條帶大小一致。其中，翌圣含有凝膠電泳驗證的一整套設(shè)備，包括高質(zhì)量瓊脂糖（Cat#10208ES）,背景干凈、帶型穩(wěn)定、大小精準的DNA marker（Cat#10501ES-10512ES）,安全無毒、穩(wěn)定性強的核酸染料YeaRed（Cat#10202ES）、YeaGreen（Cat#10204ES）,電泳儀（Cat#80310ES）等，儀器和試劑配套齊全，滿足凝膠電泳的基本需求。
酶切
還可通過菌落PCR法判斷DNA片段是否插入。是指以平板上生長的細菌菌落熱解后暴露的DNA為模板，直接使用PCR擴增技術(shù)擴增目的片段，以此來確定DNA插入片段的存在。該方法不需要提取基因組DNA，不需要酶切鑒定，快速、高效。
翌圣新品通用型多片段快速克隆試劑盒（Cat#10923ES），不經(jīng)過酶切，利用無縫克隆技術(shù)連接的目的片段，滿足6 μL小體系、25 kb以上超長片段等條件，克隆陽性率可達95%以上，轉(zhuǎn)化后再搭配使用翌圣快速PCR試劑盒（Cat#10157ES），以1 sec/kb的速度擴增5 kb以內(nèi)質(zhì)粒等，可大幅節(jié)省PCR反應(yīng)時間，快速鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。如圖3、4所示。
圖3.在6 μL小體系非復蘇感受態(tài)下，連接10 ng低投入量單片段基因。結(jié)果顯示，10923ES性能好于競品，連接效率高，菌落數(shù)多，陽性率達100%。A-B：重組轉(zhuǎn)化平板。載體（10 kb）和插入片段（1 kb）摩爾比為1:2。C：插入片段PCR鑒定電泳圖，M：Yeasen 10505ES。
圖4.以人源基因組為模板，分別擴增長度為1, 2, 3, 4, 8 kb的目的片段。PCR反應(yīng)條件使用本公司推薦的PCR反應(yīng)條件。反應(yīng)結(jié)束后，取4μL進行電泳檢測。Marker:15000bp DNA 。
通過分子克隆專題一到專題六，小翌詳細解析了分子克隆中運用到的技術(shù)和試劑。分子克隆技術(shù)打開了人類了解、識別、分離和改造基因，創(chuàng)造新物種的大門，它對于工業(yè)、農(nóng)牧業(yè)和醫(yī)學等領(lǐng)域均產(chǎn)生深遠影響，是生物研究中的手段。關(guān)注我們，小翌會在下一期的分子克隆技術(shù)專題中給大家補充分子克隆技術(shù)的應(yīng)用工具，為您的實驗帶來新的思路與方向，期待下一次的見面~
相關(guān)產(chǎn)品列表
產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 | 規(guī)格 |
藍白斑篩選 | X-Gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷 | 10901ES03/08 | 1 g/5×1 g |
IPTG 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 | 10902ES08/10 | 5 g/10 g | |
通用緩沖液，5min完成精準酶切 | FuniCut™快速限制性內(nèi)切酶 | 15001ES-15051ES | 50 T |
快速PCR，快至1s/kb | 2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix(with Dye) | 10157ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
1-7片段一步法定向連接，最快5分鐘完成重組反應(yīng) | Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit | 10923ES20/50 | 20 T/50 T |
高質(zhì)量瓊脂糖 | Agarose瓊脂糖 | 10208ES60/76 | 100 g/500 g |
核酸染料 | YeaRed Nucleic Acid Gel Stain(10,000× in Water) YeaRed核酸染料(10,000× 水溶液) | 10202ES76 | 500 μL |
YeaGreen Nucleic Acid Gel Stain (10,000×in Water) | 10204ES76 | 500 μL | |
DNA Marker | GoldBand DL2,000 DNA Marker | 10501ES60 | 100 T |
GoldBand DL600 DNA Marker | 10502ES60 | 100 T |
