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6.如細(xì)胞活率大于80%，有核率大于70%，背景干凈可以直接進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。（若細(xì)胞活性較低，也可正常提核，但是后續(xù)ATAC實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能出現(xiàn)重復(fù)率不高的情況，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)室自己的項(xiàng)目情況來具體評估）。

1.3

ATAC實(shí)驗(yàn)-細(xì)胞收集

1.獲細(xì)胞并計(jì)數(shù)：取實(shí)驗(yàn)所需數(shù)量的細(xì)胞(5萬左右)于 1.5 mL EP 管中，4℃ 2,300 rpm (500 × g)離心 5 min，吸凈管內(nèi)溶液。

【注】：對于大小不同的細(xì)胞，請根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整離心力。

2.每個(gè)樣本加入 50 μL 預(yù)冷的 Wash Buffer 重懸細(xì)胞，4℃ 2,300 rpm (500 × g)低速離心 5 min，吸凈管內(nèi)溶液。

3.每個(gè)樣本中加入 50 μL Lysis Buffer，輕輕吹打重懸，冰上放置 5 min，4℃，2,300 rpm (500 × g)離心 5 min，去除上清。

4.直接進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)座反應(yīng)。

凍存組織預(yù)處理

樣本處理

1. 將凍存小鼠肝臟組織從-80℃取出放于培養(yǎng)皿中，用刀片切下綠豆粒大?。s30mg）組織，隨后立即將培養(yǎng)皿放置冰上。

2. 組織大部分融化后，加入1mL預(yù)冷的PBS清洗小鼠肝臟組織，用移液器吸去PBS，共清洗3次。

3. 清洗完成的肝臟組織可以采用以下兩種處理方式提取細(xì)胞核，客戶可根據(jù)實(shí)際情況自行選擇。

方案一：將培養(yǎng)皿至于提取預(yù)冷的金屬塊上，在培養(yǎng)皿中，用刀片將組織切碎成顆粒狀（芝麻大?。?，加入600 μL預(yù)冷的Lysis Buffer，冰上靜置10 min。隨后用40 μm細(xì)胞篩過濾切碎的組織至1.5mL EP管中，4℃，300 g離心5 min，去上清，用200 μL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞核沉淀。取18 μL細(xì)胞核懸液，加入2 μL 0.4%臺盼藍(lán)溶液染色，顯微鏡下鏡檢，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞核的濃度。(刀片切割：細(xì)胞核懸浮液體積200 μL，細(xì)胞核濃度約750個(gè)/μL；細(xì)胞篩研磨：細(xì)胞核懸浮液體積1000 μL，細(xì)胞核濃度約2000個(gè)/ μL)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，取50000細(xì)胞核懸液，加50 μL預(yù)冷的PBS，4℃，300g離心3 min去除上清，收集細(xì)胞核。
方案二：取一個(gè)干凈的50 mL離心管，插入冰中，去掉管蓋，將40 μm細(xì)胞篩放在管口，用鑷子將培養(yǎng)皿中清洗完成的組織放置于細(xì)胞篩中央處。取少量預(yù)冷的PBS（200 μL左右，覆蓋組織塊即可）滴加到組織處，用注射器黑色的活塞頭輕輕的研磨分散組織（研磨2圈后，觀察組織分散情況，每研磨2圈加入500 μL-1000 μL預(yù)冷的PBS沖洗組織塊，總計(jì)研磨4-6圈左右，此時(shí)，50 mL離心管中溶液呈乳白色，細(xì)胞篩表面有一層組織覆蓋）。將離心管中溶液轉(zhuǎn)至1.5 mL EP管中，4℃，300 g離心5 min，去上清，用600 μL預(yù)冷的Lysis Buffer重懸細(xì)胞核沉淀，冰上靜置5min。4℃，300 g離心5min，去上清，用1000 μL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞核沉淀，隨后用40 μm細(xì)胞篩過濾重懸后的細(xì)胞核至1.5 mL EP管中。

表1-2 組織lysis buffer配方

4. 取18 μL細(xì)胞核懸液，加入2 μL 0.4%臺盼藍(lán)溶液染色，顯微鏡下鏡檢，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞核的濃度。(刀片切割：細(xì)胞核懸浮液體積200 μL，細(xì)胞核濃度約750個(gè)/μL；細(xì)胞篩研磨：細(xì)胞核懸浮液體積1000 μL，細(xì)胞核濃度約2000個(gè)/ μL)；

5. 根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，取50000細(xì)胞核懸液，加50 μL預(yù)冷的PBS，4℃，300g離心3 min去除上清，收集細(xì)胞核；

6. 處理好的細(xì)胞核立即進(jìn)行Tn5轉(zhuǎn)座法DNA建庫。

表1-3不同處理方式得到的細(xì)胞核

ATAC-seq建庫實(shí)驗(yàn)

3.1

ATAC實(shí)驗(yàn)-轉(zhuǎn)座酶片段化（0.5 h-1 h）

1.于無菌 PCR 管中配制表 2 所示反應(yīng)體系，配制好后冰上放置；

2. 將配制好的 Transposition Mix 加入到處理好的細(xì)胞核中，使用移液器輕輕吹打 5-8 次混勻；

【注】：吹打時(shí)盡量輕柔緩慢，不要產(chǎn)生氣泡，否則會(huì)對細(xì)胞核造成損傷。也不要離心，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核聚集，導(dǎo)致片段化不充分。

將上述 PCR 管置于 PCR 儀中，設(shè)置表 3 所示反應(yīng)程序，進(jìn)行片段化反應(yīng)。

4. 將反應(yīng)結(jié)束后的 PCR 管瞬離，立即向每個(gè)樣本中加入 5 μL 的 Terminate Solution，用移液器輕柔吹打 20 次混勻，室溫靜置 5 min。

3.2

ATAC實(shí)驗(yàn)-基因組 DNA 回收（0.5 h）

1. 將平衡至室溫的 DNA Extract Beads 磁珠，渦旋振蕩混勻；

2. 吸取 130 μL DNA Extract Beads 至 55 μL 終止后的片段化產(chǎn)物中，渦旋混勻或用移液器吹打混勻 10 次，室溫靜置孵育5 min；

3. 短暫離心，將離心管置于磁力架上靜置 3 min，待磁珠貼壁后吸凈 PCR 管中溶液；

4. 保持 PCR 管始終處于磁力架上，從另一側(cè)加入 200 μL 80%乙醇，避免直接沖洗磁珠，靜置 30-60 sec，吸凈 PCR 管中溶液；

5. 保持 PCR 管始終處于磁力架中，再次加入 200 μL 80%乙醇，靜置 30-60 sec，吸凈 PCR 管中溶液；

6. 保持 PCR 管始終處于磁力架中，開蓋空氣干燥至磁珠剛剛出現(xiàn)龜裂(不超過 3 min)；

7. 從磁力架上取下 PCR 管，加入 25 μL ddH2O，并充分渦旋，室溫靜置 5 min；

8. 將 PCR 管短暫離心并置于磁力架上分離磁珠和液體，待溶液澄清后(約 3-5 min)，小心轉(zhuǎn)移 23 μL 上清至新的 PCR 管中，進(jìn)行后續(xù)的文庫擴(kuò)增或者-20℃保存。

3.3

文庫擴(kuò)增（0.5 h-1h）

1. 將表 4 中試劑解凍后顛倒混勻，瞬離后置于冰上備用；

2. 于無菌 PCR 管中配制表 4 所示反應(yīng)體系；

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底；

4. 將 PCR 管置于 PCR 儀中，設(shè)置表 5 所示反應(yīng)程序，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。

3.4

文庫分選（0.5 h）

由于起始細(xì)胞量以及不同種類細(xì)胞的染色質(zhì)開放狀態(tài)差異，文庫大小可能存在不同的分布模式。通過磁珠分選，文庫中的大片段可以有效去除，使得文庫片段分布在 200-700 bp 左右。

1. 進(jìn)行雙輪分選的比例推薦 0.55×/1.0×，吸取 27.5 μL (0.55×Beads:DNA=0.55:1)平衡至室溫的 DNA Clean Beads 至步驟 5.5 的 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物中，渦旋混勻或用移液器吹打混勻 10 次，室溫靜置孵育 5 min；

2. 短暫離心，將 PCR 管置于磁力架上靜置 5 min，待溶液澄清后，小心轉(zhuǎn)移上清至新的 PCR 管中(殘留 3-5 μL，避免吸到磁珠)；

3. 渦旋振蕩混勻 DNA Clean Beads 并吸取 50 μL(1.0×，Beads:DNA=1:1)至上清中，渦旋混勻或移液器吹打混勻 10 次，室溫靜置孵育 5 min；

4. 短暫離心，將 PCR 管置于磁力架上靜置 3 min，待磁珠貼壁后吸凈 PCR 管中溶液；

5. 保持 PCR 管始終處于磁力架上，從另一側(cè)加入 200 μL 80%乙醇，避免直接沖刷磁珠，靜置 30-60 sec，吸凈 PCR 管中溶液；

6. 保持 PCR 管始終處于磁力架上，再次加入 200 μL 80%乙醇，靜置 30-60 sec，吸凈 PCR 管中溶液；

7. 保持 PCR 管始終處于磁力架上，開蓋空氣干燥至磁珠剛剛出現(xiàn)龜裂(不超過 3 min)；

8. 從磁力架上取下 PCR 管，加入 21 μL ddH2O，并充分渦旋，室溫靜置 5 min；

9. 將 PCR 管短暫離心，置于磁力架上分離磁珠和液體，待溶液澄清后(約 3-5 min)，小心轉(zhuǎn)移 20 μL 上清至新的 EP 管中，于-20℃保存。

3.5

文庫質(zhì)量控制

通常情況下，對構(gòu)建好的文庫進(jìn)行濃度和長度分布檢測，具體請參見注意事項(xiàng)，主要包括：

a. 濃度檢測：用 Qubit 對文庫的濃度進(jìn)行檢測。
b. 質(zhì)量檢測：用 Qsep 或者安捷倫 2100 檢測文庫片段分布。

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產(chǎn)品名稱	貨號	規(guī)格
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Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina®Tn5建庫專用接頭	12416ES24/96	48 T/ 192 T
1×dsDNA HS Assay Kit 即用型Qubit試劑	12642ES60/76	100 T/500 T
Qubit專用檢測管	83509ES03/10	500支/5000 支
PCR金屬磁力架	80460ES03	個(gè)