本文介紹伴刀豆球蛋白A，及其與磁珠共價偶聯(lián)后的ConA磁珠的應用場景。

伴刀豆球蛋白A磁珠 （Concanavalin A-Coated Magnetic Beads，簡稱ConA磁珠），顧名思義，就是植物凝集素伴刀豆球蛋白A（ConA）和超順磁性納米材料進行偶聯(lián)的一種生物磁珠。下面將逐一介紹有關(guān)ConA磁珠的那些事兒。

伴刀豆球蛋白A（Concanavalin A, ConA），是自1936年以來，第一個從刀豆（Canavalia ensiformis，洋刀豆）分離純化結(jié)晶的一種植物凝集素蛋白，無血型特異性。

ConA根據(jù)所處溶液pH值的不同，主要有2種形式：α-2 同源二聚體或 α-4 同源四聚體[2]。堿性條件下（pH>7.0）以四聚體（四個分子量為26kDa亞基構(gòu)成）形式存在；酸性條件（pH 4.5-5.5）下，Con A解離為活化的二聚體結(jié)構(gòu)（52kDa）。除此之外，ConA的功能受二價陽離子的影響，如在缺乏金屬離子（Ca2+ 和 Mn2+ ）的情況下，其構(gòu)象、糖蛋白結(jié)合功能是無法得到發(fā)揮[1]。

圖1.ConA分子模型(A) ConA monomer, (B) ConA dimer, (C) ConA tetramer with mannose, glucose and metal ions

生物磁珠是一類具有納米粒徑大小，由高分子聚合物和無機磁性納米粒子形成的磁性微球。磁珠按照其結(jié)構(gòu)可以分為三大類：核-殼型結(jié)構(gòu)、夾層式結(jié)構(gòu)、彌散型結(jié)構(gòu)。磁性物質(zhì)有純鐵粉、羰基鐵、磁性礦、正鐵酸鹽、鐵鈷合金等。

磁性納米材料，因其具備特殊的效應，如小尺寸效應、表面效應和量子尺寸效應等，在Fe3O4 納米顆粒的尺寸小于30 nm時, 納米顆粒內(nèi)部熱騷動的干擾表現(xiàn)顯著, 此時, 這類納米顆粒就表現(xiàn)出一種特殊的磁學性質(zhì), 即超順磁性。超順磁性Fe3O4 納米顆粒具備優(yōu)質(zhì)的屬性，如無毒、良好的生物相容性、獨特的磁靶向特性以及在交變磁場中易于產(chǎn)熱等性質(zhì), 在生物行業(yè)中得到廣泛應用。

而將ConA與微球進行共價偶聯(lián)用于固定生物分子，則有以下優(yōu)勢：

根據(jù)文獻報導，ConA磁珠的主要應用分為3種場景，分別是進行細胞質(zhì)膜分離、糖蛋白富集、和分離固定細胞方面。

利用ConA磁珠受二價陽離子的激活影響，使其存在于Ca2?和Mg2?溶液環(huán)境中，其具備的末端α-D-甘露糖基和α-D-葡萄糖基的親和作用功能，用在質(zhì)膜純化方面，是一種簡便、高效的方式。如細胞或組織的質(zhì)膜分離，是進一步獲取質(zhì)膜蛋白的關(guān)鍵步驟。而ConA是能結(jié)合細胞上糖基化蛋白，可利用此原理，獲取純度更高的質(zhì)膜。主要操作步驟為：通過將生物素化的ConA與鏈霉親和素磁珠結(jié)合，將ConA固定在磁珠上；細胞膜與ConA磁珠孵育1h；磁力架上吸附；TBS洗滌5次；洗脫液洗脫細胞質(zhì)膜溶液[3]。

圖2. ConA磁珠純化質(zhì)膜步驟

ConA對甘露糖(mannose)和葡萄糖(glucose)具有特異性，且ConA識別α-連接甘露糖，這種甘露糖恰好是許多血清和細胞膜糖蛋白的“核心寡糖"。因此可用在免疫學等方面的分離細胞或組織裂解液或血清中的糖蛋白等糖基化分子。

主要操作步驟為：通過雙功能連接劑亞油酸雙- N-羥基琥珀酰亞胺酯 (DSS) 將氨基硅烷化的磁性納米微珠（ MNPs） 與ConA進行交聯(lián)，獲取ConA磁珠；使用甲氧基乙二醇（MEG）終止磁性納米微球的非特異性結(jié)合，進行磁分離；將加入用胰蛋白酶消化的細胞膜蛋白提取液，與ConA磁珠兩者孵育，磁力架收集已結(jié)合糖蛋白的ConA磁珠，洗滌非糖肽，最后洗脫捕獲的糖肽，進行真空干燥。通過該方法，可以對腫瘤相關(guān)蛋白 (如EGFR) 的特定糖基化位點進行深入分析[4]。

圖3. 超順磁性納米顆粒偶聯(lián)不同凝集素

利用ConA磁珠（磁珠與高純度的伴刀豆球蛋白A共價結(jié)合）與細胞膜或核膜上的糖蛋白結(jié)合，從而捕獲細胞或細胞核，可實現(xiàn)少量細胞的實驗操作可視化。如ConA磁珠用于用于研究染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的新型技術(shù)的CUT&Tag和CUT&RUN[5]實驗中，通過ConA磁珠與細胞結(jié)合固定，實現(xiàn)可視化操作，避免離心帶來的細胞丟失問題。

相對傳統(tǒng)研究DNA與蛋白互作的ChIP-seq技術(shù)，CUT&Tag和CUT&RUN具備以下優(yōu)勢：

圖4. ChIP-seq，CUT&Tag，CUT RUN實驗流程示意圖

翌圣自研ConA磁珠，經(jīng)過嚴格的原料篩選、多重工藝的優(yōu)化和改善，能夠快速、高效、靈敏、特異性地與糖蛋白、糖脂、多糖等帶有糖基化修飾分子結(jié)合。主要用于分離細胞或用于分離細胞或組織裂解液或血清中的糖蛋白等糖基化修飾分子等實驗，特別直接用于CUT  &RUN和CUT&Tag（ChIP-seq實驗的革新性技術(shù)）等實驗。

相同數(shù)量細胞與磁珠結(jié)合孵育相同時間，細胞分析儀下自動檢測ConA磁珠結(jié)合后剩余細胞數(shù)量，結(jié)果顯示翌圣ConA磁珠（Cat#19810）優(yōu)于競品。

10µL翌圣ConA磁珠（Cat#19810）和10µL競品ConA磁珠，都可結(jié)合E7級別數(shù)量的細胞，與競品相當。重復操作下，細胞捕獲率>90%。

按1 mL/管進行分裝。儲存條件分別為：4℃，37℃加速處理2天、4天、7天、11天和14天，-20℃破壞處理1天、3天、6天和8天。結(jié)果顯示同等實驗條件下：4℃保存產(chǎn)品、37℃加速處理和-20℃破壞處理的產(chǎn)品細胞捕獲率＞95%，各處理條件下，3組重復CV值在1%以內(nèi)，重復性良好。

參考文獻：

[1].R A Bryce, I H Hillier, J H Naismith, Carbohydrate-protein recognition: molecular dynamics simulations and free energy analysis of oligosaccharide binding to concanavalin A. Biophys J. 81 (Sept. 2001): 1373-88. Abstract. PubMed. Web. 3 Sept. 2010.

[2].Chun-Yang Li, Huai-Long Xu, Bo Liu, Jin-Ku Bao, Concanavalin A, from an Old Protein to Novel Candidate Anti-Neoplastic Drug, Curr Mol Pharmacol. 2010 Nov;3(3):123-8.

[3].Yu-Chen Lee 1, Gregory Block, Huiwen Chen, et al, One-step isolation of plasma membrane proteins using magnetic beads with immobilized concanavalin A, Protein Expr Purif. 2008 Dec;62(2):223-9.

[4].Juanilita T Waniwan, Yi-Ju Chen, Rey Capangpangan, Glycoproteomic Alterations in Drug-resistant Non-small Cell Lung Cancer Cells Revealed by Lectin Magnetic Nanoprobe-based Mass Spectrometry, J Proteome Res. 2018 Nov 2;17(11):3761-3773.

[5].Hatice S Kaya-Okur, Derek H Janssens, Steven Henikoff, Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag, Nat Protoc. 2020 Oct;15(10):3264-3283.