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行業(yè)痛點
隨著診斷試劑盒開發(fā)人員不斷要求降低檢測所需的樣本量，對 PCR/mNGS/tNGS等主流檢測方法的要求越來越高，需要更高的靈敏度來檢測目標核酸。當只有少數目標分子可用時，市售的常規(guī)Taq DNA聚合酶里面含有的DNA基因組殘留導致的DNA污染的問題會加劇，微量的污染DNA可能會產生非特異性擴增，使得擴增效率降低，影響陽性判斷值的確定，降低檢測試劑開發(fā)的靈敏度，給開發(fā)者帶來極大的阻礙和挑戰(zhàn)。
此外，當檢測靶標與擴增體系里殘留的宿主DNA和外源核酸相關時，往往出現NTC和陰性樣本起峰的現象，影響最終結果判讀。
如圖1，樣本B的擴增Ct值與NTC的越接近，結果就越不確定；好的結果需要NTC和樣本曲線之間有良好的分離。
如果樣本中的目標物濃度越來越低，改進檢測?法的有效途徑是將NTC曲線進?步向右移動（更大的Ct值）。使?潔凈的分子酶原料通常會將NTC曲線向右移動，從?獲得更好的結果：
---來?相同樣本的檢測可靠性（即樣本與陰性對照的更好分離）；
---在相同確定性下檢測的下限進一步提高（即樣本與?模板對照仍能分離，檢測到更低?平的?標）。
圖1. 樣本A比樣本B濃度更高，但大多數樣本的?標物或模板物濃度較低，更類似于樣本B，NTC越靠后，檢測靈敏度和可靠性更高
解決方案
為達到早篩早診的目的，樣本濃度越來越低，宿主核酸和背景菌的干擾，容易導致漏檢或不確定結果，降低診斷試劑盒檢測的靈敏度和可靠性。
為了解決病原檢測中背景菌及宿主核酸殘留帶來的干擾問題，為臨床分子診斷試劑盒開發(fā) 、科研機構等提供更潔凈、更高性能的分子酶原料，翌圣生物開發(fā)了的超低殘留去除技術，建立了遵循GMP標準的超潔凈分子酶生產基地-UCF.ME，以及嚴格按照ISO13485質量管理體系進行各環(huán)節(jié)把關，嚴控人（人員）、機（機器）、料（試劑、耗材）、法（工藝）、環(huán)（環(huán)境）、測（標準），有效的技術手段、潔凈的生產環(huán)境和嚴格的質量控制結合，既控制外源性污染，又做好內源性雜質去除，從而實現超凈分子酶的開發(fā)目標。這些分子酶原料的潔凈度相較常規(guī)商業(yè)產品高出幾個數量，是要求高靈敏度和可靠性的應用中的理想選擇 。
圖2. 翌圣超低殘留分子酶質量監(jiān)控流程圖
超低殘留去除技術
常規(guī)分子酶生產工藝需要的純化步驟多，且產量較低。制備低殘留高純度的分子酶產品時，產量與純度之間難以平衡，且可控性差，合格率低，因而導致批次間差異較大。翌圣生物開發(fā)的超低殘留去除技術純化步驟由繁變簡，有針對性的去除相關殘留，在精準高效地去除殘留的同時，提高純化工藝的穩(wěn)定性與產量，降低批間差。
圖3. 翌圣超低殘留去除技術示意圖
GMP標準的UCF.ME®超潔凈分子酶生產基地
UCF.ME：Ultra Clean Factory . Molecular Enzyme，即超潔凈分子酶生產制造。
封閉系統(tǒng)：全封閉的生產系統(tǒng)，無菌的罐子和管路，以及支持全生產線在線清潔的全自動CIP/SIP系統(tǒng)，降低了DNA污染的可能。
環(huán)境控制：在符合D級、C級和局部潔凈室標準的環(huán)境中生產，防止接觸DNA污染物，保證了酶的潔凈度。
硬件保障：按照工藝需求進行深度定制的全進口生產設備，支持關鍵參數全程在線監(jiān)控和反饋調整，確?？刂茀档木珳识龋瑫r還保證數據的可追溯性。
水質控制：按現行2020版中國藥典標準嚴格執(zhí)行，從源頭上保證生產用水的無菌性。
規(guī)模效應：噸級以上量產，確保了產品的均一性、穩(wěn)定性和供貨的及時性，有利于成本控制。
ISO13485質量管理體系
翌圣生物是家以分子酶產品通過ISO 13485:2016質量體系認證的企業(yè)，從原料采購、生產管理、質量控制、倉儲運輸等各個環(huán)節(jié)都嚴格在質量體系的監(jiān)管下開展，生產、檢驗過程實施動態(tài)監(jiān)控，對現場發(fā)現人的著裝、設備的狀態(tài)、物料的進出、方法的確認、環(huán)境的維護、測量的運行等方面的問題，分析產生的具體原因，協(xié)助責任部門共同完成整改，以保證生產、檢驗操作，按照標準SOP進行，有據可依，有章可循，為持續(xù)輸出質量穩(wěn)定的、滿足法規(guī)和顧客需求的產品，提供質量保證。
圖4. 翌圣ISO13485認證超潔凈分子酶生產基地
同時，使用翌圣生物自研的高靈敏度E.coli 宿主細胞 DNA 殘留檢測試劑盒在不同階段精心追蹤分子酶樣品，最大限度降低最終分子酶產品核酸污染的風險。
平臺產出
鑒于目前分子診斷試劑盒開發(fā)企業(yè)對于DNA/RNA全預混熒光定量PCR原料的迫切需求，諸多研究人員都在研究過程中發(fā)現使用低殘留的分子酶原料，開發(fā)全預混體系的成功率更高。
此外，在常規(guī)酶原料和低殘留酶原料的篩選、測試過程中，研發(fā)人員發(fā)現低殘留原料對于部分體系的檢測性能有提高，如Ct值提前等。
翌圣生物推出了全套低殘留酶原料，包括 Taq DNA 聚合酶、逆轉錄酶、UDG 酶、RNase 抑制劑及適配 buffer 組分，旨在滿足科研和工業(yè)用戶開發(fā)更潔凈、高性能分子診斷試劑盒的需求。適用于以下應用體系的開發(fā)：
低殘留體系開發(fā)：開發(fā)體系檢測靶標與常見宿主E.Coli及環(huán)境背景菌基因組DNA序列一致或者比較相似，可選擇該套低殘留酶原料進行體系開發(fā)，這套酶原料對DNA污染控制在極低水平（如Taq DNA聚合酶E. coli基因組DNA殘留＜0.02copy/100U）。
高靈敏度體系開發(fā)：在進行高靈敏度體系的開發(fā)，或對現有產品進行迭代以提升試劑盒檢測靈敏度的項目中，也可選擇這套低殘留酶原料。更純凈的酶原料能降低體系中序列的復雜度，提高引物與目標模板結合的擴增效率，從而提升低濃度模板的檢出率，同時增大與無模板對照（NTC）的分離程度，有助于確定試劑盒更高的檢測靈敏度。
全預混體系開發(fā)：針對全預混體系開發(fā)，這套低殘留酶原料選用 20 多套不同來源的引物探針，進行了 37℃ 7 天全預混穩(wěn)定性的質量控制，確保其在全預混體系開發(fā)方面具有通用性。此外，該原料采用單組分的產品形式，為試劑盒開發(fā)者在體系調試時提供了更高的靈活度，更有利于開發(fā)適配性更佳、性能更優(yōu)的 qPCR/RT-qPCR 全預混體系。
部分性能展示：
E. coli基因組DNA殘留＜0.02 copies/ 100 U，保持行業(yè)水平
qPCR體系全預混性能：37℃加速7天，穩(wěn)定性高
圖6. 分別使用低殘留和常規(guī)的Taq DNA聚合酶、UDG酶，搭配相同的反應buffer，和HPV、內標引探與所有試劑組分提前預混，在37℃條件下放置7天，與-20℃正常保存的試劑，同時檢測濃度為10 拷貝/微升的模板，結果顯示，常規(guī)單酶在熱加速處理后熒光值會出現不同程度的降低，而低殘留單酶在37℃加速7天后，與-20℃正常保存的試劑相比，擴增曲線峰形、熒光值、Ct值都沒有變化，穩(wěn)定性更高。
RT-qPCR體系全預混性能：37℃加速5天，穩(wěn)定性高
圖7. 使用低殘留逆轉錄酶、Taq酶、UDG酶和RNase抑制劑，配置成RT-qPCR體系，將各類靶標引探與所有試劑組分提前預混，在37℃條件下放置5天，與-20℃正常保存的試劑同時擴增Ct值35左右的模板核酸，結果顯示，該體系在37℃加速5天后，與-20℃正常保存的試劑相比，擴增曲線峰形、熒光值、Ct值基本沒有變化，檢出率一致，RNA全預混體系穩(wěn)定性高。
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