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DNA建庫(kù)磁珠——你選對(duì)了嗎？背景介紹磁珠是高通量測(cè)序過(guò)程產(chǎn)品，通過(guò)磁顆?；钚曰鶊F(tuán)在一定條件下可與核酸結(jié)合和解離的原理，將樣本中目的片段分離?？蓪?shí)現(xiàn)對(duì)核酸樣本的高通量自動(dòng)化操作，廣泛應(yīng)用于基因測(cè)序以及分子診斷領(lǐng)域。商業(yè)化磁珠產(chǎn)品體系一般包含：磁珠、聚乙二醇（PEG）、鹽離子等。基于SPRI(SolidPhaseReversibleImmobilization)技術(shù)，DNA在一定濃度的PEG存在條件下，NaCl或MgCl2促進(jìn)條件下，DNA分子構(gòu)象會(huì)發(fā)生急劇變化，會(huì)暴露出磷酸骨架上大量的帶負(fù)電荷的
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基因治療領(lǐng)域的*--mRNA疫苗據(jù)路透社3月15日?qǐng)?bào)道：美國(guó)政府正試圖說(shuō)服疫苗研發(fā)的德國(guó)公司CureVac搬遷到美國(guó)并壟斷其疫苗生產(chǎn)，而德國(guó)政府希望該公司能留在本國(guó)。那么，CureVac公司擁有什么重要的東西竟讓兩個(gè)國(guó)家政府直接出面進(jìn)行爭(zhēng)奪？答案就是——mRNA疫苗制備技術(shù)。什么是mRNA疫苗mRNA疫苗是將RNA在體外進(jìn)行相關(guān)的修飾后傳遞至機(jī)體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并產(chǎn)生蛋白抗原，從而導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答，進(jìn)而擴(kuò)大機(jī)體的免疫能力[1,3]。圖1：直接注射mRNA疫苗效果示意圖[2]mRNA疫苗的
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測(cè)序數(shù)據(jù)不好？是不是建庫(kù)出了問(wèn)題？
測(cè)序數(shù)據(jù)不好？是不是建庫(kù)出了問(wèn)題？！——從測(cè)序數(shù)據(jù)看文庫(kù)構(gòu)建高通量測(cè)序中的文庫(kù)構(gòu)建指的是在DNA兩端連接特定的接頭從而使其符合測(cè)序平臺(tái)要求的過(guò)程，在高通量測(cè)序過(guò)程中，文庫(kù)質(zhì)量直接影響終測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，打個(gè)比方，如果文庫(kù)上機(jī)測(cè)序的濃度很低，樣本在FlowCell上擴(kuò)增所形成的DNA樣本簇就會(huì)很少，測(cè)序數(shù)據(jù)量也將減少，這就可能導(dǎo)致測(cè)序失敗，所以我們說(shuō)文庫(kù)的質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)估也是NGS中的關(guān)鍵步驟。文庫(kù)如何質(zhì)控？評(píng)估文庫(kù)質(zhì)量的方法有哪些？文庫(kù)質(zhì)控：文庫(kù)在上機(jī)之前都有會(huì)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，質(zhì)量檢測(cè)合格的文庫(kù)才 -
逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)做不好，是不是引物出了問(wèn)題
實(shí)驗(yàn)室常用到的實(shí)驗(yàn)：逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)人員通過(guò)體外模擬病毒復(fù)制過(guò)程，以提取的RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄酶催化，合成出與RNA互補(bǔ)的cDNA鏈。終構(gòu)建cDNA文庫(kù)，并從中篩選所需的靶標(biāo)基因。BUT！小伙伴們做逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)時(shí)，1）有沒(méi)有深究過(guò)RNA逆轉(zhuǎn)錄出的cDNA能不能真實(shí)反映出基因表達(dá)信息？2）做實(shí)驗(yàn)時(shí)，有沒(méi)有發(fā)生過(guò)內(nèi)參做的很好，目的基因做不出的情況？如果有發(fā)生上述情況，那么需要重新評(píng)估逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性。逆轉(zhuǎn)錄結(jié)果有效性的評(píng)定逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性的評(píng)定重要的是盡可能反映樣本中原始RNA模板的信息， -
雙判定標(biāo)準(zhǔn)判定qPCR擴(kuò)增特異性，提升Ct值真實(shí)性
qPCR實(shí)驗(yàn)易做，但數(shù)據(jù)分析并非想象中的那么容易！數(shù)據(jù)分析的好與壞，極大程度上依賴(lài)于qPCR原始結(jié)果的質(zhì)量。qPCR結(jié)果的評(píng)價(jià)指標(biāo)?溶解曲線，是qPCR結(jié)果判定的第—要素。它的作用是判定目的基因是否得到擴(kuò)增。理論上，當(dāng)反應(yīng)體系中僅是目標(biāo)基因的擴(kuò)增，才是有效擴(kuò)增。?標(biāo)準(zhǔn)曲線，是qPCR結(jié)果判定的金標(biāo)準(zhǔn)。（在溶解曲線判定為特異性擴(kuò)增后）它的作用是測(cè)定引物的擴(kuò)增效率及試劑的檢測(cè)上下限。根據(jù)文章發(fā)表對(duì)于qPCR數(shù)據(jù)的要求，擴(kuò)增效率應(yīng)在90-110%。?擴(kuò)增曲線，是直接生成qPCR定量的數(shù)據(jù)，即Ct值。從 -
qPCR進(jìn)階攻略—帶你玩轉(zhuǎn)儀器設(shè)置
熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)是分子實(shí)驗(yàn)室常用的一項(xiàng)技術(shù)。持續(xù)關(guān)注小翊的應(yīng)該都掌握了高質(zhì)量cDNA的獲取方法，引物設(shè)計(jì)指南以及反應(yīng)體系的配制技巧（還未get的小伙伴戳文末鏈接），然而上機(jī)時(shí)，發(fā)現(xiàn)和別人的反應(yīng)條件不一致卻又不敢動(dòng)儀器？本期小翊將帶你玩轉(zhuǎn)qPCR儀器的設(shè)置！目前市面上的qPCR儀器種類(lèi)五花八門(mén)，但基本上儀器的設(shè)置都相對(duì)一致。我們以ABI7500為例進(jìn)行介紹。反應(yīng)板設(shè)置實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇：我們將實(shí)驗(yàn)命名為“Yeasen”，進(jìn)行“Quantitation：ΔΔCt”實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法選擇：如選用SYBRGre -
dsDNAHSAssayKitforQubit®——給我5min，還你一個(gè)準(zhǔn)確定量結(jié)果1產(chǎn)品概述dsDNAAssayKitforQubit®是Yeasen生物開(kāi)發(fā)的專(zhuān)門(mén)用于Qubit®熒光儀或熒光酶標(biāo)儀的試劑盒，線性范圍0.2-100ng，即使在存在ssDNA、RNA和單體核苷酸的條件下，也可以選擇性的檢測(cè)dsDNA，且耐受較高濃度的蛋白質(zhì)、鹽類(lèi)、洗滌劑等污染物。2產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)1）操作簡(jiǎn)便——5min之內(nèi)出結(jié)果2）高選擇性——對(duì)dsDNA具有高度選擇性，不定量RNA和ssDNA。圖dsDNAAssa
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遺傳中心法則表明，DNA是生物體內(nèi)遺傳信息的載體。遺傳信息在精密的調(diào)控下從DNA轉(zhuǎn)錄成RNA，再傳遞到蛋白質(zhì)。因此RNA被認(rèn)為是DNA與蛋白質(zhì)之間生物信息傳遞的“橋梁”，在研究轉(zhuǎn)錄組信息中占有著重大的作用。背景介紹轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）是指在某一特定的生理?xiàng)l件下，細(xì)胞、組織或者生物體內(nèi)所有的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，即轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA總和，包括編碼RNA（即mRNA）和ncRNA（tRNA、rRNA、miRNA、lncRNA、circRNA）等不同類(lèi)型的RNA分子。在這之中核糖體RNA(
