產品信息

Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit是一款簡便、快速、高效的DNA定向克隆產品，該試劑盒可以將PCR產物定向克隆至任何載體的任何位點，可高效克隆50 bp-10 kb片段。將載體線性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對應的*一致的序列。PCR產物和線性化載體在重組酶的作用下，僅需50℃反應20 min即可進行轉化，完成定向克隆?？寺￡栃月士蛇_95%以上。

試劑盒中2×Hieff Clone® MultiS Enzyme Premix預混了重組酶和重組反應所需緩沖液，并添加了*的重組增強因子，可顯著提高重組克隆效率。使用該試劑盒，可以一次實現(xiàn)多至5個片段的順序拼接克隆。

產品組分

快速克??；定向克?。欢c突變。

運輸與保存方法

冰袋運輸。-20℃保存，有效期1年。

注意事項

1）為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
2）本產品僅作科研用途！

實驗流程

① 載體線性化：酶切或反向PCR制備線性化載體。

② 插入片段的制備：由PCR制備，所用擴增引物在設計時需在其5’端添加同源序列（圖中以紅色、黃色、紫色和綠色標記)，使得擴增產物之間以及擴增產物與線性化載體之間各有一段同源序列。

一. 制備線性化載體

選擇合適的克隆位點，并對載體進行線性化。建議盡量選擇無重復序列且GC含量均勻的區(qū)域進行克隆。載體克隆位點上下游25 bp區(qū)域內GC含量均在40%-60%范圍內最佳。線性化載體可通過限制性內切酶酶切或反向PCR擴增獲得。

1.酶切制備線性化載體
1）雙酶切線性化：線性化*，轉化背景低。建議使用。
2）單酶切線性化：線性化程度較差。可適當延長酶切時間以降低轉化背景。
【注】：不含插入片段的假陽性克隆是由未線性化環(huán)狀載體轉化而形成的。若這種假陽性克隆比例較高，建議重新制備線性化載體。

2.反向PCR擴增制備線性化載體

建議使用高保真聚合酶（如：Hieff Canace^® High-Fidelity DNA Polymerase，Cat No. 10135ES）進行載體擴增，以減少擴增突變的引入。PCR擴增模板應盡量使用預線性化質粒，以防止殘留環(huán)狀質粒模板對克隆陽性率的影響。

Hieff Clone^®重組反應體系兼容幾乎所有酶切反應體系和常規(guī)PCR反應體系，當載體酶切產物或反向PCR擴增產物純度較高時，可以無需純化，直接進行重組反應。但純度較低且有可能含有未線性化環(huán)狀質粒時，建議使用高質量的試劑盒對線性化載體進行膠回收純化，以提高產物純度并去除一部分未線性化的環(huán)狀載體，有利于提高重組效率。

二. PCR擴增制備插入片段

1.設計擴增引物

Hieff Clone® 引物設計方式：通過在插入片段正、反向PCR引物的5’端引入15-25 bp（不包括酶切位點）的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對應的*一致的序列。

推薦使用翌圣無縫克隆引物設計軟件（122.112.245.84:8080/hieff-clone/），自動生成插入片段的擴增引物。若手動設計，可參照以下實例。以在pUC18載體（注：與該試劑盒中提供的C組分不同，C組分為pUC19）的EcoR I 和Hind III 酶切位點間插入三段基因的引物設計為例，引物具體設計方案如下：

首先設計第一片段的正向擴增引物和第三片段的反向擴增引物(與載體相鄰的兩個插入片段)。

第一片段正向擴增引物設計方式：

5’—上游載體末端同源序列+酶切位點（可保留或刪除）+第一片段基因特異性正向擴增序列—3’

第三片段反向擴增引物設計方式：

3’—第三片段基因特異性反向擴增序列+酶切位點（可保留或刪除）+下游載體末端同源序列—5’

【注】：
① 基因特異性正/反向擴增序列即常規(guī)插入片段正/反向擴增引物序列；

② 上游/下游載體末端同源序列為線性化載體最末端序列（用于同源重組），GC含量40%-60%為佳。

其次設計第一片段的反向擴增引物和第二片段的正向擴增引物。用于片段之間進行重組的同源序列可以添加至前方片段的反向擴增引物中，也可以添加至后方片段的正向擴增引物中，還可以兩片段各添加一部分。以將同源序列添加至前方片段 （第一片段）的反向擴增引物中為例，引物具體設計方案如圖3所示：
第一片段反向擴增引物設計方式：
3’—第一片段基因特異性反向擴增序列+第二片段5’端同源序列—5’
第二片段正向擴增引物設計方式：
5’—第二片段基因特異性正向擴增序列—3’

【注】：
① 基因特異性正/反向擴增序列即常規(guī)插入片段正/反向擴增引物序列；
② 第二片段5’端同源序列即用于第一片段與第二片段進行重組的添加序列。

最后設計第二片段的反向擴增引物和第三片段的正向擴增引物。設計方式與第一片段的反向擴增引物和第二片段的正向擴增引物設計方式一致。          

【注】：最終引物長度超過40 bp，建議選用PAGE純化方式進行引物合成。計算擴增引物退火溫度時，只需計算基因特異性擴增序列的Tm值，載體末端同源序列不應參與計算，為了得到高效率克隆，建議Tm≥48℃。

2.插入片段PCR擴增

插入片段擴增可用任意PCR酶擴增，無需考慮產物末端有無A尾 (重組過程中將被去除，在最終載體中不會出現(xiàn))。但為了減少擴增突變的引入，建議使用高保真聚合酶進行擴增（Hieff Canace® High-Fidelity DNA Polymerase，Cat No. 10135ES）。

PCR擴增結束后，取少量產物進行瓊脂糖凝膠電泳以檢驗擴增產量和特異性。Hieff Clone®重組反應體系兼容常規(guī)PCR反應體系。因此，如果擴增模板不是與載體抗性相同的環(huán)狀質粒，且PCR產物電泳條帶單一，則擴增產物可以無需純化，直接用于重組反應。但PCR擴增產物純度較低時，建議使用高質量的試劑盒對PCR擴增產物進行膠回收純化，以提高產物純度，有利于提高重組效率。

三. 線性化載體與插入片段濃度測定

推薦使用瓊脂糖凝膠電泳比較條帶亮度的方法對DNA進行定量。將線性化載體和插入片段擴增產物做數個等體積稀釋梯度，原始產物和稀釋后產物各取1 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，與DNA分子量標準（DNA Marker）比較條帶亮度以確定其近似濃度。

四. 重組反應

1. 線性化載體與插入片段使用量計算

Hieff Clone^® Plus Multi重組反應體系最適DNA使用量為每片段（包括線性化載體）0.03 pmoL。該摩爾數對應的DNA質量可由以下公式粗略計算獲得：
每片段最適使用量= [0.02×載體堿基對數]ng (0.03 pmoL)

例如，將長度為0.5kb、1kb、2 kb三插入片段克隆至長度為5 kb的載體時，各片段最適使用量應為：
線性化載體最適使用量：0.02 × 5000 = 100 ng；
0.5kb插入片段最適使用量應為：0.02 × 500 = 10 ng；
1 kb插入片段最適使用量應為：0.02 × 1000 = 20 ng；
2 kb插入片段最適使用量應為：0.02 × 2000 = 40 ng。

【注】：
1）插入片段DNA使用量應大于10 ng。當使用上述公式計算DNA最適使用量低于這個值時，直接使用10 ng即可。
2）線性化載體的使用量應在50-200 ng之間。當使用上述公式計算最適使用量超出這個范圍時，則選擇低或高使用量即可。
3）線性化載體和插入片段擴增產物未純化，直接使用時，使用總體積應不超過反應體系體積的1/5，如20 μL體系不超過4 μL。

2.反應體系（推薦冰上配制，各組分使用前需混勻）

【注】：
1）X和Y分別是根據公式計算得到線性化載體和插入片段用量。
2）陰性對照-1可用來確認線性化載體有無環(huán)狀質粒殘留，可選擇性進行。
3）當插入片段擴增模板是與載體抗性相同的環(huán)狀質粒時，可用陰性對照-2來確認有無環(huán)狀質粒模板殘留，可選擇性進行。
4）試劑盒中提供陽性對照反應所需組分（B組分和C組分），可用來排除其他實驗材料及操作因素的影響，可選擇性進行。

3.重組反應

1）體系配制完成后，用移液器輕輕吸打混勻各組分，短暫離心將反應液收集至管底。
2）置于50℃反應20 -50 min。當插入片段總和＞5 kb時，建議提高孵育時間到30-50 min可以增大重組效率。
注：建議在PCR儀或水浴鍋等溫控精確的儀器上進行反應。

3）待反應完成后，建議將反應管置于冰上冷卻5 min，以防溫度過高降低感受態(tài)轉化效率。

4）反應產物可直接進行轉化，也可儲存于-20℃，待需要時解凍轉化。

五. 重組產物轉化、涂板

1）在冰上解凍克隆感受態(tài)細胞（如：DH5α Chemically Competent Cell，Cat No. 11802ES）。

2）取10 μL冷卻重組產物，加入到100 μL感受態(tài)細胞中，輕彈管壁數下混勻，在冰上放置30 min。

3）42℃熱激90秒，冰浴孵育2 min。

4）加入900 μL SOC或LB培養(yǎng)基，37℃孵育10 min充分復蘇。37℃，200 rpm，搖菌45 min。
5）5000 rpm離心3 min，棄掉900 μL上清。用剩余培養(yǎng)基將菌體重懸，用無菌涂布棒在含有正確抗性的平板上輕輕涂勻。待菌液被吸收，將平板倒置，于37℃過夜培養(yǎng)。

六. 克隆鑒定

方便快捷的方法是菌落PCR。用無菌的槍頭或牙簽將單個菌落挑至20-50 μL LB培養(yǎng)基中混勻，直接取1 μL作為PCR模板。推薦至少用一條通用測序引物進行菌落PCR，這樣可以避免PCR假陽性的產生。后續(xù)也可做酶切或測序鑒定。

應用實例

圖4. Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit進行三片段克隆。

A：重組轉化平板。B：插入片段和載體濃度檢測電泳圖。C：PCR方法鑒定每個單片段和最終連接基因。箭頭指示目的條帶。載體：pCAMIBA1302，10 kb，三個插入片段長度：1 kb，1.5 kb和2.5 kb，重組反應條件：50℃，20 min。

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