Hieff NGS® Methyl-seq DNA Library Prep Kit for Illumina V2是針對(duì)Illumina®測序平臺(tái)專業(yè)開發(fā)設(shè)計(jì)的新一代DNA甲基化建庫試劑盒，在前一代建庫試劑盒的基礎(chǔ)上，改善了接頭連接效率，并采用了更加新型的高保真酶，顯著提高擴(kuò)增均一性和保真性。適用于各種經(jīng)Bisulfite處理的樣本類型，包括gDNA、FFPE DNA、cell free DNA (cfDNA)、ChIP DNA等，可以滿足Bisulfite處理后的10 pg~250 ng DNA樣本建庫。該試劑盒可兼容短至40 bp的DNA樣本。本產(chǎn)品不僅更加經(jīng)濟(jì)，同時(shí)也提供了簡便快速的建庫流程，一般在2小時(shí)左右可以完成正常建庫。

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸。所有組分-20 °C保存，有效期1年。

注意事項(xiàng)

一、關(guān)于操作

1. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2. 請(qǐng)于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 配制各步驟反應(yīng)液時(shí)推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會(huì)造成文庫產(chǎn)出下降。

4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時(shí)請(qǐng)更換槍頭。

5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。

6. PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測區(qū)進(jìn)行強(qiáng)制性的物理隔離；使用專用的移液器等設(shè)備；并定時(shí)對(duì)各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進(jìn)行擦拭清理），以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈度。

7. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

案例展示

a. gDNA樣本建庫示例

圖 2：human gDNA 樣本 bisulfite 處理后的 Aligent 2100 建庫示意圖

注：50 ng human gDNA使用ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit (D5005)處理后，全部投入建庫，PCR 擴(kuò)增10 cycle 得到的文庫產(chǎn)量約為20×58.2 ng；

b. FFPE DNA樣本建庫示例

圖 3：FFPE DNA 樣本bisulfite 處理后的 Aligent 2100 建庫示意圖

注：50 ng FFPE DNA 使用ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit (D5005)處理后，全部投入建庫，PCR 擴(kuò)增 10 cycle 得到的文庫產(chǎn)量約為  20×74.8 ng；

c. cfDNA樣本建庫示例

圖 4：cfDNA 樣本 bisulfite 處理后的 Aligent 2100 建庫示意圖

注：10ng cfDNA 使用 ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit (D5005)處理后，全部投入建庫，PCR 擴(kuò)增 11 cycle 得到的文庫產(chǎn)量約為 20×54.4 ng；

常見問題

DNA 文庫產(chǎn)量偏低，出現(xiàn)接頭二聚體，大片段等問題，可以考慮從如下方面進(jìn)行優(yōu)化：

1. a)文庫產(chǎn)量偏低，應(yīng)考慮樣本溶液中含有酶抑制劑組分，建議再次純化；

2. b)文庫出現(xiàn)接頭二聚體，推薦在互補(bǔ)鏈延伸之后進(jìn)行2輪純化，在第一輪純化后用50 μL洗脫，然后加入1.2×beads (60 μL)進(jìn)行再次純化；

3. c)對(duì)于文庫大片段的出現(xiàn)，考慮是過度擴(kuò)增引起，可以適當(dāng)減少擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。