TRIzol伴侶使用手冊

產品及特點

TRIzol是美國Invitrogen公司的、用于總RNA提?。ㄖ饕莿游锟?/span> RNA提?。┑漠a品，具有廣大的客戶群。但其缺點之一是一直沒有柱式 升級產品，客戶仍然要使用既繁瑣又費事的非柱式操作（另一缺點是不能用于 富含多糖和多酚的材料））為解決此問題，我們特推出本產品，主要特點是：跟TRIzol結合使用，把經典操作變成了柱式操作，簡化了實驗流程，用戶可 以節(jié)約 30 分鐘的時間。其他特點如下:

• RNA質量更好，因為操作簡短減少了 RNA 在提取過程中的降解。
• RNA純度更高，OD260/OD280 一般在 1.9 以上，比經典 TRIzol 法得到的更純。
• 專門的洗滌條件能有效去除基因組 DNA，進一步減少其對 RNA 的污染。
• 適用于其他基于酸酚/ 異硫氰酸胍提取原理的RNA提取產品, 包括TRIzol、TRIzol LS、TRI Reagent 等。
• 可以省略氯處理步驟，避免接觸有毒試劑（但效果稍差））。

規(guī)格及成分

運輸及保存

常溫運輸和保存，有效期一年。

自備試劑

TRIzol 或 TRIzol 同類產品、氯

使用方法

• 按 TRIzol 的使用手冊進行總 RNA 提取到加氯之前一步。
• 如果需要加氯，則繼續(xù)按TRIzol的使用手冊操作，用氯處理裂解液離心后得到上清液。如果省略氯處理步驟，則需要將裂解物直接離心。
• 將經過氯處理得到的上清液或沒有經過氯處理直接離心得到的裂解液轉移至一個干凈的 1.5 mL 塑料離心管中。注意：如果是經過氯處理，則離心后，下層有機相和中間層將含有DNA和蛋白質，避免觸及，否則將產生蛋白質和 DNA 污染。為保險起見，可以留下100 μL上清液不取。同時吸取上清時緩慢進行，否則容易吸出交界面的不可見的絲狀DNA。
• 加入等體積的柱式動物RNAout溶液B，顛倒混勻 30 秒。
• 根據混合物的多少，一次或分兩次轉移到離心吸附柱中。
• 每次轉移后，需要13000-15000 g室溫離心半分鐘，棄收集管中的穿透液。
• 加0.7 mL通用洗柱液到離心吸附柱中，室溫離心半分鐘，棄收集管中的穿透液。一次洗滌一般足夠去除雜質。但如果樣品OD260/280比值不高，可以再用0.3 mL通用洗柱液重復此步一次。
• 室溫離心半分鐘。此步對去除殘留通用洗柱液十分重要，否則殘留的通用洗柱液會影響RNA的質量和使用。
• 將離心吸附柱轉移到一自備的RNase-free收集管中，加入50-100 μL RNA洗脫液。
• 室溫離心半分鐘，離心管中溶液即為RNA樣品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
• RNA完整性的電泳檢測：如果需要做Northern雜交，強烈建議用戶使用甲醛變性膠進行RNA電泳，因為非變性膠不能分離所有的RNA分子（BioTechniques，28：414，2000）。
• RNA產量產率測定：將5-10 μL RNA溶于TE緩沖液中（pH 7.5-8.2 之間）檢測其在OD260的光吸收。通過光吸收可以得出RNA濃度（1 OD260的RNA=40 μg/mL），進而計算出RNA的產量（濃度 X 體積）和產率（RNA產量/組織用量）。
• RNA純度測定：無污染的總RNA的OD260/OD280一般在1.8-2.1 之間（具體數值與其堿基組成和溶液成分等多種因素有關），高于此范圍則分別表示樣品可能有蛋白質污染，但一般不影響RT-PCR等反應。

疑難解答

Q：上樣孔里的紅色熒光物一定是DNA污染嗎？

A：不是。用TAE或TBE電泳液和非變性膠電泳RNA時容易產生此現象，天澤基因初步研究發(fā)現大部分紅色熒光物是變性不充分的單鏈RNA通過堿基互補或通過硼酸絡合（如果使用TBE作電泳液的話）形成的復合物，加RNase處理后，這些紅色熒光物（RNA）一般會消失。為避免此現象，建議使用甲醛變性膠電泳和RNA上樣液（如天澤基因的 RNAon）。

Q：如何確認和去處除污染的基因組DNA？

A：如果懷疑有DNA污染，可以用RNase處理RNA樣品，然后再電泳。如果上樣孔里的紅色熒光物不消失，則表示是基因組DNA污染。進一步確認可以使用PCR擴增法。去除污染的DNA可以使用天澤基因的非酶的 DNA去除劑DNA Erasol或RNase-free DNase，由于RNase-free DNase一般都有殘留的RNase污染，所以必須嚴格按照廠家提供的手冊進行操作。