實驗背景

細胞三磷酸腺苷(ATP)的產(chǎn)生速率是一種描述細胞代謝的信息含量很高的測量，因為

ATP是細胞內(nèi)普遍存在的主要能量貨幣。細胞的代謝調(diào)控使細胞根據(jù)ATP需求的變化調(diào)整ATP產(chǎn)生的變化來維持總的細胞內(nèi)的ATP水平。

  安捷倫Seahorse XF實時ATP速率測定被設(shè)計用來測量活細胞總的ATP產(chǎn)生速率。更重要的是，這個實驗?zāi)軌騾^(qū)分哺乳動物細胞內(nèi)兩條主要的產(chǎn)生ATP的代謝途徑線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）和糖酵解ATP的產(chǎn)生。

常見問題

• 如果檢測液中含有不同的氧化底物（不同的P/O值），mitoATP產(chǎn)生速率如何計算？

    為了將ATP偶聯(lián)的呼吸轉(zhuǎn)換為線粒體的ATP產(chǎn)生速率，在電子傳遞鏈末端每還原一個氧原子，ADP磷酸化為ATP的化學(xué)計量學(xué)必須得到確定。不同的底物理論上最大的P/O值不同，并且依賴于化學(xué)計量學(xué)/底物氧化通路，以及F₁F₀ ATP合酶的效率。在標準的XF實驗條件下，細胞被供給底物混合物（主要是葡萄糖，丙酮酸和谷氨酰胺），且通常內(nèi)源性底物儲備（糖原，脂肪酸，其他氨基酸）可用于線粒體氧化。因此，用幾種細胞系進行了測試并確認P/O值2.75準確代表了外源性和內(nèi)外源性氧化底物混合物的平均P/O值。

當(dāng)進行誘導(dǎo)的XF實時ATP速率測定時，誘導(dǎo)的速率是如何計算和報告的？

     在XF實時ATP速率誘導(dǎo)實驗中Summary Printout和Measure Sheet中的 Average Assay Parameter Calculations顯示的Induced Rate(s)是用急性注射和寡霉素注射之間所有測量的平均值計算的。然而，每個時間點的誘導(dǎo)速率可以從Kinetic Rate Data（Measure Sheet）中獲得。

• XF實時ATP速率測定中定義的XF      ATP速率指數(shù)是什么？

    XF ATP速率指數(shù)是mitoATP產(chǎn)生速率與glycoATP產(chǎn)生速率的比值（即mitoATP rate/glycoATP rate）。這個比值是一個細胞代謝表型的定量指標。代謝指數(shù)大于1代表大于50%的細胞ATP來自線粒體的ETC/氧化磷酸化，而指數(shù)小于1表示大于50%的總ATP是糖酵解途徑產(chǎn)生的。因為代謝指數(shù)是比值測量，所以它對于代謝表型的改變或轉(zhuǎn)換是高度敏感的。

• 為什么相同的細胞類型當(dāng)細胞以不同的密度種板時XF      ATP速率不一樣？

    細胞的代謝表型會被細胞對ATP的需求所影響。一般來說，處于增殖或分化中的細胞比融合（緩慢生長）或末端分化的細胞擁有更高的糖酵解速率。為了比較實驗之間的結(jié)果，推薦在整個研究過程中保持一致的細胞培養(yǎng)條件和細胞接種密度。

• 為什么必須用Seahorse      XF DMEM培養(yǎng)基，pH 7.4或Seahorse      XF RPMI培養(yǎng)基，pH 7.4來進行這個實驗？

       GlycoATP產(chǎn)生速率的計算需要對XF實時ATP速率測定中的糖酵解質(zhì)子流出速率進行絕對測量。為了正確計算PER，檢測液必須要有一個固定的緩沖能力。培養(yǎng)基中低濃度的HEPES 在實驗的時間范圍內(nèi)提供了一致的緩沖能力值。雖然添加HEPES緩沖液輕微地減少了ECAR信號，但是它顯著提高了ECAR數(shù)據(jù)的質(zhì)量和一致性，以及轉(zhuǎn)換為PER的準確性（更多詳情，請參閱White paper: Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology）。此外，使用預(yù)調(diào)pH到7.4的XF DMEM或XF RPMI培養(yǎng)基節(jié)省了實驗準備的時間，確保XF實驗過程中一致的檢測液pH值。

• 我能夠使用其他的Seahorse      XF檢測液來運行XF實時ATP速率測定嗎？

   GlycoATP產(chǎn)生速率的準確計算需要使用一種沒有酚紅和碳酸氫鈉且低濃度HEPES緩沖液的檢測液。因此，強烈推薦使用安捷倫Seahorse XF DMEM（或RPMI），pH 7.4的培養(yǎng)基。任何偏離推薦的培養(yǎng)基和補充劑（葡萄糖，丙酮酸鈉，谷氨酰胺），需要根據(jù)經(jīng)驗（使用XF分析儀）確定每個實驗的緩沖系數(shù)（參閱Seahorse XF Buffer Factor Protocol以進一步了解信息）。任何含有酚紅的檢測液不能在XF實時ATP速率測定中使用。

• 當(dāng)運行誘導(dǎo)的XF實時ATP速率測定時，寡霉素注射之后的OCR高于基礎(chǔ)OCR，發(fā)生了什么？

     在寡霉素注射之前加入的化合物使電子傳遞與氧化磷酸化解偶聯(lián)（如FCCP，DNP等等），通常會導(dǎo)致OCR增加。然而，這種呼吸不與ATP的產(chǎn)生偶聯(lián)，因為沒有ATP合酶的參與，線粒體膜電位會減少或消除，所以在這種環(huán)境下很少或沒有ATP生成。在這些情況下，基礎(chǔ)的mitoATP產(chǎn)生速率不能夠被準確計算。如果懷疑存在解偶聯(lián)化合物，那么推薦添加一組對照組，注射檢測液+溶劑來計算基礎(chǔ)的mitoATP產(chǎn)生速率。