游離脂肪酸測(cè)定試劑盒：快速定量分析，適用于組織、細(xì)胞及體液樣本

脂肪酸是末端為羧酸的碳?xì)滏湣Ｋ鼈冏鳛槟芰縼?lái)源、結(jié)構(gòu)組分以及多種生物活性化學(xué)物質(zhì)（統(tǒng)稱(chēng)為氧化脂質(zhì)）的前體，在生物體內(nèi)具有重要作用，這些生物活性物質(zhì)具有多種生物學(xué)功能，包括促炎和抗炎、血管活性、自分泌和旁分泌功能。AkrivisBio的游離脂肪酸檢測(cè)試劑盒提供了一種簡(jiǎn)單、靈敏的方法，用于測(cè)量多種生物樣本中的游離脂肪酸。該檢測(cè)基于脂肪酸轉(zhuǎn)化為輔酶A衍生物，隨后被氧化，同時(shí)生成化學(xué)計(jì)量的過(guò)氧化氫，用于氧化ADHP，產(chǎn)生與脂肪酸含量成正比的顏色和熒光。反應(yīng)中加入增強(qiáng)劑以促進(jìn)顏色和熒光的發(fā)展。

艾美捷游離脂肪酸測(cè)定試劑盒：

貨號(hào)：MA-0111

規(guī)格：100孔

樣本類(lèi)型：組織提取液、細(xì)胞裂解液、血清、血漿、尿液、其他生物流體

適用物種：通用（適用于所有物種）

檢測(cè)方法：比色法（檢測(cè)波長(zhǎng)570納米）或熒光法（激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)=535/587納米）

檢測(cè)類(lèi)型：定量

應(yīng)用：基于微孔板的比色法/熒光法檢測(cè)，用于測(cè)量樣本中游離脂肪酸的濃度。

靈敏度：>2微摩爾

儲(chǔ)存條件：-20°C

運(yùn)輸條件：凝膠冷藏包

游離脂肪酸測(cè)定試劑盒檢測(cè)組分：

-檢測(cè)緩沖液：25毫升，貨號(hào)WMMA-0111A

-ADHP溶液：200微升，紅色，貨號(hào)MA-0111B

-?；o酶合成酶：凍干粉，藍(lán)色，貨號(hào)MA-0111C

-?；o酶氧化酶/辣根過(guò)氧化物酶：凍干粉，綠色，貨號(hào)MA-0111D

-增強(qiáng)劑：200微升，紫色，貨號(hào)MA-0111E

-棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品（1mM）：300微升，黃色，貨號(hào)MA-0111F

游離脂肪酸測(cè)定試劑盒檢測(cè)原理：

1.脂肪酸轉(zhuǎn)化為酰基輔酶A。

2.酰基輔酶A被氧化，生成過(guò)氧化氫。

3.過(guò)氧化氫被過(guò)氧化物酶利用，將ADHP氧化為熒光素，產(chǎn)生強(qiáng)烈的顏色和熒光。

用戶自備材料：

-脂質(zhì)提取材料（參見(jiàn)AkrivisBioPI-0101脂質(zhì)提取試劑盒）

-Polytron或勻漿器

-濾器

儲(chǔ)存和處理：

將試劑盒儲(chǔ)存于-20°C。使用前將所有組分恢復(fù)至室溫。

-ADHP溶液：DMSO在略低于室溫時(shí)會(huì)凍結(jié)。使用前必須恢復(fù)至室溫。儲(chǔ)存于-20°C。

-酰基輔酶合成酶；酰基輔酶氧化酶/辣根過(guò)氧化物酶：用220微升去離子水復(fù)溶凍干酶并混合。儲(chǔ)存于-20°C。

-棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品：棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品冷凍后可能會(huì)分成兩相。為了使用，將其置于熱水浴（約80-100°C）中加熱至高于80°C，直至溶液超過(guò)其濁點(diǎn)，變得非常渾濁。在加熱時(shí)渦旋混合。隨著溶液冷卻，它將再次變得清澈。重復(fù)加熱/冷卻循環(huán)一次，標(biāo)準(zhǔn)品即可使用。

檢測(cè)步驟：

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線：

-比色法檢測(cè)（0-10納摩爾/孔范圍）：將0、5、10、15、20、25微升的棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品分別加入96孔板的多個(gè)孔中。用檢測(cè)緩沖液將所有孔的體積調(diào)整至50微升。這樣每孔分別含有0、2、4、6、8、10納摩爾的標(biāo)準(zhǔn)品。

-熒光法檢測(cè)（<1納摩爾/孔）：將棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋10倍至40微摩爾，方法是將50微升標(biāo)準(zhǔn)品加入450微升檢測(cè)緩沖液中，然后將0、5、10、15、20、25微升的標(biāo)準(zhǔn)品分別加入96孔板的多個(gè)孔中。用檢測(cè)緩沖液將所有孔的體積調(diào)整至50微升，這樣每孔分別含有0、200、400、600、800、1000皮摩爾的標(biāo)準(zhǔn)品。

2.樣本準(zhǔn)備：

-液體樣本可以直接加入96孔板中，并用檢測(cè)緩沖液將所有孔的體積調(diào)整至50微升。未知樣本的響應(yīng)必須在所用標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)。如果未知樣本超出此范圍，則必須稀釋并重新運(yùn)行。

-細(xì)胞（10?）或組織（10毫克）用5%異丙醇/5%Tergitol溶液在小勻漿器中提取，然后過(guò)濾以去除不溶物和細(xì)胞碎片。樣本已準(zhǔn)備好使用。溶液可能呈渾濁狀，但這不影響檢測(cè)。每個(gè)檢測(cè)使用1-20微升樣本。

3.?；o酶合成：向所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣本孔中加入2微升酰基輔酶合成酶。混合并孵育30分鐘（37°C）。

4.氧化和顯色反應(yīng)混合液：根據(jù)要運(yùn)行的孔數(shù)（樣本和標(biāo)準(zhǔn)品）準(zhǔn)備足夠的反應(yīng)混合液。每個(gè)孔準(zhǔn)備總共50微升的反應(yīng)混合液，包含：

-檢測(cè)緩沖液：44微升

-?；o酶氧化酶/辣根過(guò)氧化物酶：2微升

-ADHP溶液：2微升

-增強(qiáng)劑：2微升

-向每個(gè)孔中加入50微升反應(yīng)混合液。在37°C下孵育反應(yīng)30分鐘，避光。通過(guò)在微孔板讀數(shù)器中以動(dòng)力學(xué)模式測(cè)量反應(yīng)進(jìn)程，觀察顏色或熒光的發(fā)展是有用的。

5.測(cè)量：通過(guò)比色法（570納米吸光度）或熒光法（激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)=535/587納米）監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的信號(hào)不再變化時(shí)，反應(yīng)完成。達(dá)到終點(diǎn)的時(shí)間應(yīng)少于30分鐘。

6.典型結(jié)果：

7.計(jì)算：從所有讀數(shù)中減去0納摩爾標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。斜率定義了系統(tǒng)的靈敏度（吸光度/納摩爾游離脂肪酸）。將背景校正后的樣本讀數(shù)除以斜率，以確定游離脂肪酸的納摩爾含量。將結(jié)果轉(zhuǎn)換回原始樣本中的含量：

-原始游離脂肪酸含量=從標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和未知吸光度確定的納摩爾數(shù)，校正稀釋?zhuān)?/span>

-1.確定的納摩爾游離脂肪酸/加入孔中的樣本體積=樣本中的游離脂肪酸納摩爾/微升

-2.樣本中的游離脂肪酸納摩爾/微升×樣本總體積=樣本中的總游離脂肪酸納摩爾

-3.樣本中的總游離脂肪酸納摩爾/細(xì)胞數(shù)量或組織毫克數(shù)=每細(xì)胞或每毫克組織的游離脂肪酸納摩爾