IKCA1 (KCNN4) HEK293 細胞系 返回列表頁

IKCA1（KCNN4）HEK293細胞系是表達人類IKCA1的工程化HEK293細胞，也稱為KCNN4（中等電導鈣激活鉀通道蛋白4），IK1，hKCa4和hSK4，Genbank登錄號NM_002250。該細胞系已通過使用膜電位敏感熒光染料（DiBAC4(3)）的細胞實驗和西方印跡法對IKCA1表達進行驗證。

背景

IKCA1，也稱為中等電導鈣激活鉀通道蛋白4，IK1，hKCa4和hSK4，是可能的異源四聚體電壓獨立鉀通道的一部分，該通道由細胞內(nèi)鈣激活。激活后會跟隨膜超極化，促進鈣內(nèi)流。編碼的蛋白可能是T淋巴細胞中主要的鈣激活鉀通道的一部分，但它也存在于內(nèi)皮細胞和心臟成纖維細胞中。它們有助于血管平滑肌細胞增殖、遷移和心臟纖維化。在乳腺癌（BC）細胞中發(fā)現(xiàn)IKCA1高水平存在，耗竭后導致腫瘤形成減少。IKCA1可以被小分子調(diào)節(jié)，這些可能在BC和心血管疾病治療中提供z療機會。

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應(yīng)用

在研究和藥物發(fā)現(xiàn)過程中篩選和驗證IKCA1的激動劑和拮抗劑。

細胞解凍

1. 從液氮儲存中取出一個細胞小瓶。在準備好解凍之前，保持在干冰上。

2. 準備好解凍時，在37°C水浴中搖晃裝有冷凍細胞的小瓶大約60秒。細胞解凍后（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將小瓶的全部內(nèi)容轉(zhuǎn)移到一個空的50毫升錐形管中。

注意：在37°C水浴中放置細胞過久將導致活性迅速喪失。

3. 使用10毫升的血清學移液管，慢慢向含有細胞的錐形管中加入10毫升預熱的解凍培養(yǎng)基1。解凍培養(yǎng)基1應(yīng)滴加同時輕輕搖晃錐形管，以實現(xiàn)溫和混合并避免滲透沖擊。

4. 立即以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養(yǎng)基并將細胞在5毫升預熱的解凍培養(yǎng)基1中重懸。

5. 將重懸的細胞轉(zhuǎn)移到T25或T75培養(yǎng)瓶中，并在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

6. 培養(yǎng)24小時后，檢查細胞附著和活性。更換培養(yǎng)基為新鮮的解凍培養(yǎng)基1，并繼續(xù)在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到細胞準備好分裂。

7. 細胞應(yīng)在w全融合前傳代。在s次傳代及后續(xù)傳代中，使用生長培養(yǎng)基1B。

細胞傳代

1. 抽去培養(yǎng)基，用無Ca2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細胞，并用0.05% y酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入生長培養(yǎng)基1B并轉(zhuǎn)移到試管中。

3. 以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養(yǎng)基并將細胞在生長培養(yǎng)基1B中重懸。

4. 按照推薦的亞培養(yǎng)比例1:10至1:20，每周一次或兩次將細胞種入新的培養(yǎng)容器中。

細胞冷凍

1. 抽去培養(yǎng)基，用無Ca2+/Mg2+的PBS沖洗細胞，并用0.05% y酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入生長培養(yǎng)基1B并計數(shù)細胞。

3. 以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養(yǎng)基并將細胞在4°C冷凍培養(yǎng)基（BPS Bioscience #79796）中重懸，細胞濃度約為2 x 10^6個細胞/ml。

4. 將1 ml的細胞懸浮液分裝到每個冷凍小瓶中。將小瓶放入保溫容器中緩慢冷卻，并在-80°C下保存過夜。

5. 次日將小瓶轉(zhuǎn)移到液氮中長期保存。

注意：建議在早期傳代時擴增細胞并至少冷凍10個小瓶以備將來使用。

圖1. 離子霉素誘導的細胞內(nèi)鈣水平增加激活在IKCA1（KCNN4）HEK293細胞系中表達的IKCA1通道。

IKCA1（KCNN4）HEK293細胞和野生型HEK93細胞與DiBAC4(3)預孵化，然后用離子霉素（1 μM）處理。通過測量細胞熒光（λ激發(fā)485±10nm，λ發(fā)射528±10nm）監(jiān)測通道激活。結(jié)果表明，用離子霉素處理的IKCA1-HEK293細胞由于通道激活引起的超極化而表現(xiàn)出熒光減少。值表示為添加離子霉素后/添加離子霉素前的細胞熒光。

文獻參考：

Ghanshani S., et al., J Biol Chem. 275(47): 37137-37149.

Hoffman J.F., et al., 2003 PNAS 100 (12): 7366-7371.

de-Allie F.A., et al., 1996, Br J Pharmacol. 117(3):479-487.

Terstappen G.C., et al., 2003 Neurosci Lett. 346(1-2):85-88.

Gross D., et al., 2022 Cell Death and Disease 13:902.

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