T4 DNA連接酶：克隆、文庫構(gòu)建與基因合成的關(guān)鍵工具

T4 DNA連接酶（T4 DNA Ligase）是一種來源于 T4噬菌體 的酶，能催化DNA分子中相鄰的 5'-磷酸基團（5'-P） 和 3'-羥基（3'-OH） 之間形成磷酸二酯鍵，實現(xiàn)DNA片段的共價連接。它是分子生物學(xué)中常用的工具酶之一。

1.反應(yīng)條件

底物：雙鏈DNA中的切口（nick）、粘性末端或平末端。

輔因子：需要 ATP（腺苷三磷酸） 作為能量來源。

最適溫度：16–25°C（但平末端連接通常在低溫下進行以提高效率）。

緩沖液：含Mg2?的緩沖體系（如Tris-HCl、DTT等）。

2. 功能特點

高效連接粘性末端（互補突出端）。

可連接平末端（但效率較低，需更高酶量或PEG優(yōu)化）。

修復(fù)DNA鏈中的單鏈切口（如PCR產(chǎn)物或限制酶切后的缺口）。

3.應(yīng)用

a. 分子克隆

載體與插入片段連接：將外源DNA片段（如PCR產(chǎn)物）插入質(zhì)粒載體，用于轉(zhuǎn)化和擴增。

無縫克?。℅ibson Assembly替代方案）：通過優(yōu)化反應(yīng)條件實現(xiàn)多片段組裝。

b. 文庫構(gòu)建

NGS文庫制備：連接測序接頭（adapters）到DNA片段兩端。

cDNA文庫構(gòu)建：連接雙鏈cDNA與載體。

c. 突變修復(fù)與合成生物學(xué)

定點突變：連接突變引物擴增的DNA片段。

基因合成：組裝寡核苷酸片段為完整基因。

d. 其他應(yīng)用

熒光標(biāo)記探針制備：連接熒光標(biāo)記的核苷酸。

DNA損傷修復(fù)研究：模擬細(xì)胞內(nèi)DNA連接過程。

T4 DNA連接酶因其高效性和廣泛適用性，已成為基因工程和DNA研究的核心工具之一。