在生產(chǎn)消費(fèi)品時(shí)，有效地清潔生產(chǎn)設(shè)備對(duì)質(zhì)量控制來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。清潔工藝的目標(biāo)是降低產(chǎn)品污染的風(fēng)險(xiǎn)，有效的清潔工藝可以將風(fēng)險(xiǎn)降低到可接受的水平，以確保產(chǎn)品質(zhì)量。如果無(wú)法衡量和驗(yàn)證清潔工藝的有效性，就無(wú)法了解產(chǎn)品質(zhì)量和消費(fèi)者安全的風(fēng)險(xiǎn)。

總有機(jī)碳（TOC）分析是消費(fèi)品生產(chǎn)商廣泛采用的非專(zhuān)屬方法，用于檢測(cè)產(chǎn)品、清潔劑、以及微生物等污染物的殘留量。

為了證明TOC分析法適用于預(yù)期用途，我們對(duì)設(shè)備清潔之后可能尚存的殘留物進(jìn)行了回收和線性研究。工廠通常會(huì)測(cè)試化學(xué)污染物和化合物，但很少用TOC分析法來(lái)測(cè)試微生物的回收率。本文旨在探討對(duì)于清潔驗(yàn)證和確認(rèn)，TOC分析法能否證明可接受的微生物污染回收率和線性。

我們同科羅拉多大學(xué)博爾德分校合作，用一整夜時(shí)間在胰酶大豆肉湯中培養(yǎng)100毫升枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。以4500轉(zhuǎn)/分鐘的速度將最終培養(yǎng)物的十毫升等分試樣離心分離10分鐘，形成細(xì)胞沉淀。

在每次離心之間，倒出上面的液體，用渦旋混合方法用10毫升超純水使沉淀細(xì)胞重新懸浮。重復(fù)此過(guò)程7次。設(shè)計(jì)淋洗循環(huán)以除去細(xì)胞培養(yǎng)基帶來(lái)的TOC污染。在第7次淋洗循環(huán)后，根據(jù)已有的4,6-二氨基-2-苯基吲哚（4,6-diaminidino-2-phenylindole，DAPI）染色任務(wù)來(lái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重新懸浮、稀釋、計(jì)數(shù)（見(jiàn)圖1）。

圖 1：枯草芽孢桿菌在細(xì)胞計(jì)數(shù)的熒光顯微鏡成像

確定細(xì)胞密度之后，用Sievers® M9 TOC分析儀測(cè)量1 ppm確認(rèn)標(biāo)樣組，然后進(jìn)行三次細(xì)胞濃度稀釋。在測(cè)量TOC之后，用0.45 μm滅菌過(guò)濾器過(guò)濾剩余樣品，除去細(xì)菌（見(jiàn)圖2）。然后再次測(cè)量TOC以確定每個(gè)樣品的非細(xì)胞背景TOC（見(jiàn)圖2）。

圖2：枯草芽孢桿菌的過(guò)濾過(guò)程

表 1：微生物細(xì)胞密度與TOC的相關(guān)性結(jié)果

圖 3：微生物細(xì)胞密度與TOC的線性關(guān)系

在進(jìn)行微生物TOC定量之后，分別將1毫升的每種細(xì)胞密度溶液放在不銹鋼試樣板上進(jìn)行試樣污染，然后使試樣干燥。此試樣污染的目的是確定微生TOC相關(guān)結(jié)果的目視檢測(cè)限。圖4是微生物試樣污染圖。

圖 4：微生物試樣板污染

微生物TOC相關(guān)結(jié)果和試樣污染圖都說(shuō)明了連續(xù)監(jiān)測(cè)已有的清潔工藝有效性的重要性。在理想光線下，很容易在試樣板上看到最高細(xì)胞密度（5.8E+07細(xì)胞/mL）的污染斑。而對(duì)于較低細(xì)胞密度，即使光線很好，也很難在試樣板上看到污染斑。這表明除了強(qiáng)有力的清潔工藝之外，還需要用非目測(cè)的方法來(lái)測(cè)試清潔工藝的有效性。

根據(jù)收集的數(shù)據(jù)，可以想象用于生產(chǎn)消費(fèi)品的設(shè)備上仍有顯著微生物污染，卻僅憑目視檢查就被投放到生產(chǎn)中，導(dǎo)致嚴(yán)重后果。因此必須連續(xù)監(jiān)測(cè)已有的清潔工藝的有效性，才能降低產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)和消費(fèi)者安全風(fēng)險(xiǎn)。

最后，由于微生物分子組成的不確定性，很難確定微生物溶液的回收率。本研究根據(jù)先前在確定活性微生物細(xì)胞中的碳含量時(shí)的發(fā)現(xiàn)，旨在確定微生物溶液的理論回收率。圖5是理論微生物TOC產(chǎn)出量的計(jì)算過(guò)程。基于每個(gè)細(xì)胞的碳原子參考數(shù)，5.8E+07細(xì)胞/mL的理論TOC濃度為11.6 ppm。

圖 5：理論微生物 TOC 產(chǎn)出量的維度分析

在本文的實(shí)驗(yàn)中，測(cè)量到5.8E+07細(xì)胞/mL的TO實(shí)際回收值為9.13 ppm，對(duì)挑戰(zhàn)性的化合物的回收率為78.7%，從而證明實(shí)驗(yàn)方法是成功的。

1. Recall Index and Spotlight. Expert Solutions

2. DAPI Protocol For Fluorescence Imaging Thermo-Fisher Scientific – US

3. Phillips, Rob, and Ron Milo. “A Feeling for the Numbers in Biology." Proceedings of the National Academy of Sciences 106, no. 51 (December 22, 2009): 21465.