TUNEL檢測(cè)技術(shù)服務(wù) 返回列表頁

1.用二甲苯浸洗2次，每次5min;

2.用梯度7醇(100.95.90.80、70%)各浸洗1次，每次3min:注:上面兩步是針對(duì)石蠟切片樣木的外理

3.用Proteinase K作液外理組織15 30 min 在21-370(溫度、時(shí)間、濃度均需摸索)或者加細(xì)胞通透液8min

4.PBS漂洗2次;

5.制備TUNEL反應(yīng)混合液，處理組用50ulTdT+450ul 熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻;而陰性對(duì)照組僅加50ul 熒光素標(biāo)記的dUTP液，陽性對(duì)照組先加入100ul DNase 1，反應(yīng)在15~25℃x10min，后面步驟同處理組。

6.玻片干后，加50uI TUNEL反應(yīng)混合液(陰性對(duì)照組僅加50u熒光素標(biāo)記的dUTP液)于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃x1h。

7.PBS漂洗3次;

8. 可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞(激發(fā)光波長為450~500nm，檢測(cè)波長為515~565nm);

9.玻片干后加50ul converter-POD干標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37°cx30min.

10.PBS漂洗3次，

11.在組織處加50~100uIDAB底物，反應(yīng)15~25℃℃x10min;

12.PBS漂洗3次;

13.拍照后再用蘇木素或電其綠復(fù)染，幾秒后立即用自來水沖洗。梯度灑精脫水，二電苯透明，中性樹膠封片。

14.加一滴PBS或甘油在視野下，用光學(xué)顯微錯(cuò)觀察凋廣細(xì)胞(共計(jì)200~500個(gè)細(xì)胞)并拍照，可結(jié)合調(diào)廣細(xì)胞形太特征來綜合判斷(未染色細(xì)胞變小，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)凋亡小體，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)鄒縮、變圓、脫落;而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體。

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