Stbl3感受態(tài) 技術新聞

Stbl3：                                                              100μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                         10μl

保存條件(保質期)：                                 -80℃（6個月） 

基因型

F- mcrB mrr hsdS20(r_B^-, m_B^-) recA13 supE44 ara-14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20 (Str^R) xyl-5 λ^-leu mtl-1 endA1+

產(chǎn)品說明

Stbl3菌株來源于 HB101 E. coli strain，是慢病毒載體系統(tǒng)推薦使用的菌株?；蚪M含有重組酶recA13突變，可有效抑制長片段末端重復區(qū)的重組，降低錯誤重組的概率；但不含核酸酶endA1突變，體內核酸酶含量較高，提取質粒時務必使用質粒提取試劑盒中去蛋白液。此菌株具有鏈霉素抗性，不存在lacI^qZΔM15，不可用于藍、白斑篩選。Stbl3感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19檢測轉化效率>10⁸cfu/μg DNA。 

操作方法

1. Stbl3感受態(tài)細胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA (質?；蜻B接產(chǎn)物) 并用手打EP管底輕輕混勻 (避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動會降低轉化效率。

3. 向離心管中加入0.9 mL室溫S.O.C.或LB培養(yǎng)基(S.O.C.營養(yǎng)豐富，可提高轉化效率)。

4. 37℃，225 rpm復蘇60分鐘或30℃，225 rpm復蘇90分鐘。

(當質粒中含有不穩(wěn)定片段時，30℃培養(yǎng)可降低錯誤重組的概率，若轉化control pUC19計算轉化效率，則需37℃，225 rpm復蘇60分鐘）

5. 5000rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應抗生素的S.O.C. 或LB培養(yǎng)基上。

6. 將平板倒置放于37℃或30℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

(當質粒中含有不穩(wěn)定片段時，30℃培養(yǎng)可降低錯誤重組的概率，若轉化control pUC19計算轉化效率，則需37℃培養(yǎng)過夜)

注意事項

1. 對不穩(wěn)定DN片段的克隆或逆轉錄病毒/慢病毒載體的構建，涂板后平板應在30℃培養(yǎng)，以減少發(fā)生錯誤重組的概率。

2. 制備高純度病毒質粒時，應使用新鮮轉化的平板接菌，新鮮菌液提取質粒，菌液不可低溫保存后使用。

3. 對不穩(wěn)定的克隆或病毒質粒優(yōu)先以質粒狀態(tài)保存，盡量避免將質粒保存在大腸桿菌細胞中。

4. S.O.C.或LB培養(yǎng)基均可使用，S.O.C.可提高轉化效率20%；實驗人員可選擇在37℃或30℃培養(yǎng)細胞，37℃條件下，菌生長速度加快，有利于提高質粒產(chǎn)量，30℃培養(yǎng)可降低錯誤重組概率。

5. 感受態(tài)細胞好在冰中緩慢融化。插入冰中8分鐘內加入目標DNA，不可在冰中放置時間過長，長時間存放會降低轉化效率?；烊肽康腄NA時應輕柔操作。

6. 轉化高濃度的質?；蚋咝实倪B接產(chǎn)物可相應減少終用于涂板的菌量