DH10Bac感受態(tài) 技術(shù)新聞

DH10Bac：                                                100μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                   10μl

保存條件(保質(zhì)期)：                            -80℃（6個(gè)月） 

基因型

F- mcrA ?(mrr-hsdRMS-mcrBC) ?80lacZ?M15 ?lacX74 recA1 endA1 araD139 ?(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG /pMON14272 / pMON7124

產(chǎn)品說明

DH10Bac菌株主要用于生產(chǎn)重組桿狀病毒分子（Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)）。該菌株中含有父本桿粒 bMON14272 、輔助質(zhì)粒 pMON7124 ：父本桿粒 bMON14272包含 mini-F復(fù)制子, 卡那抗性基因, attTn7 位點(diǎn)和 lacZα互補(bǔ)因子；輔助質(zhì)粒 pMON7124 含有 tnsABCD區(qū)（tnsABCD region supplies the transposition proteins required for insertion of the mini-Tn7 from the donor plasmid into its target site on the parent bacmid），具有四環(huán)素抗性，在細(xì)胞擴(kuò)增過程中丟失，但可提高供體質(zhì)粒pFastBac（具有慶大霉素抗性）轉(zhuǎn)化后的基因轉(zhuǎn)座效率。mcrA、mcrBC及mrr突變使DH10Bac菌株適合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA（Therefore , genomic DNA , both  prokaryotic and eukaryotic, can be cloned efficiently in DH10Bac）。recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。?80lacZΔM15 的存在使DH10Bac可用于藍(lán)白斑篩選，DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>10⁸cfu/μg DNA。

操作方法

供體質(zhì)粒（pFastBac等）轉(zhuǎn)化重組方法：

1. DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入供體質(zhì)粒（pFastBac等）1ng，并用手打EP管底混勻，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰中并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

3. 向離心管中加入900μl不含抗生素的SOC液體培養(yǎng)基，37℃，225 rpm復(fù)蘇4小時(shí)。

4. 復(fù)蘇完成后，用SOC稀釋轉(zhuǎn)化液到（10-1，10-2），每個(gè)稀釋用吸取100ul鋪一個(gè)LB平板（共涂3個(gè)平板），平板包含50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，7ug/ml tetracycline，40ug/ml X-gal，40ug/ml IPTG。

5. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱48h（抗生素含量較高，需在37度長時(shí)間培養(yǎng)才能挑到合適克?。?。

  陽性驗(yàn)證：

  1. 挑10個(gè)白色的克隆，重新劃線在LB平板（50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，7ug/ml tetracycline，40ug/ml X-gal，40ug/ml IPTG）。37度過夜培養(yǎng)。

2. 挑選白色的克隆，轉(zhuǎn)接到含有50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，7ug/ml tetracycline的LB培養(yǎng)液中，過夜培養(yǎng)。

3. 使用試劑盒（QIAGEN cat. 12162）或異丙醇-醋酸鈉法抽提重組質(zhì)粒DNA（＞100kb）。使用PCR法分析重組質(zhì)粒是否正確重組。

pUC19檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率方法：

1. DH10Bac感受細(xì)胞態(tài)從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA（質(zhì)粒或連接產(chǎn)物）并用手撥EP管底混勻，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰中并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

3. 向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)液LB，37℃，200 rpm復(fù)蘇60分鐘。

4. 取100μl轉(zhuǎn)化液涂布到含50-100ug/ml氨芐的LB平板上。

5. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱12-16h，統(tǒng)計(jì)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。

注意事項(xiàng)

1. 感受態(tài)細(xì)胞好在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過長，長時(shí)間存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少終用于涂板的菌量。

3. 涂板時(shí)務(wù)必涂干，平板表面不留任何水份。