BJ5183-AD-1感受態(tài) 技術新聞

BJ5183-AD-1：                                                   100μl/支

pCAMBIA2301(control vector，10ng/μl):                10μl

保存條件(保質期)：                                     -80℃（6個月） 

基因型

endA1 sbcBC recBC galK met thi-1 bioT hsdR (Str^R) [pAdEasy-1 (Amp^R)] 

產(chǎn)品說明

BJ5183-AD-1是攜帶了腺病毒質粒pAdeasy-1的BJ5183菌株。BJ5183菌株是一種具有較高重組活力的大腸桿菌菌株，是目前腺病毒系統(tǒng)常用的感受態(tài)細胞。BJ5183菌株含有sbcBC recBC雙重突變，賦予BJ5183細胞較強的重組能力，有利于轉入的目的基因與腺病毒骨架質粒的重組。endA1（缺失核酸內(nèi)切酶）的突變有利于重組DNA的穩(wěn)定和高純度質粒DNA的提取。BJ5183-AD-1菌株細胞中已經(jīng)提前轉入了腺病毒質粒pAdeasy-1[encodes the Adenovirus-5 genome (E1/E3 deleted)]，賦予該菌株氨芐抗性，在病毒質粒構建時，只需轉入線性化的目的質粒即可，簡化了實驗步驟，提高了病毒質粒重組概率。Str^R 賦予BJ5183-AD-1菌株鏈霉素抗性。BJ5183-AD-1感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作，pCAMBIA2301質粒(size:1163bp)檢測轉化效率>1×10⁵ cfu/μg DNA。

操作方法

1. BJ5183-AD-1感受態(tài)細胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的質粒（含有目標基因并線性化），并用手打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰中并靜置2分鐘，晃動會降低轉化效率。

3.向離心管中加入700 μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基 (2YT或LB)，混勻后37℃，200 rpm復蘇60分鐘。

4. 5000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。

5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

注意事項

1. 感受態(tài)細胞在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標DNA，不可在冰中放置時間過長，長時間存放會降低轉化效率。

2. 混入目的DNA時應輕柔操作。

3. BJ5183-AD-1菌株的質粒產(chǎn)量不高。腺病毒構建成功后，可選擇在其他大腸桿菌菌株中擴繁，純化質粒。

4. BJ5183-AD-1感受態(tài)細胞對溫度敏感，應儲存在-80℃超低溫冰箱，避免溫度波動，溫度波動會降低感受態(tài)轉化效率。