BJ5183感受態(tài) 技術(shù)新聞

BJ5183：                                                    100μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                   10μl

保存條件(保質(zhì)期)：                            -80℃（6個(gè)月）

基因型

產(chǎn)品說明

BJ5183是一種具有較高重組活力的大腸桿菌菌株，是目前腺病毒系統(tǒng)常用的感受態(tài)細(xì)胞。BJ5183菌株含有sbcBC recBC雙重突變，賦予BJ5183細(xì)胞較強(qiáng)的重組能力，有利于轉(zhuǎn)入的目的基因與腺病毒質(zhì)粒{pAdeasy-1[encodes the Adenovirus-5 genome (E1/E3 deleted)]或pAdeasy-2[encodes the Adenovirus-5 genome (E1/E3/E4 deleted)]}的重組。endA1（缺失核酸內(nèi)切酶）的突變有利于重組DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。Str^R 賦予BJ5183菌株鏈霉素抗性。BJ5183感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>5×10⁸ cfu/μg DNA。

操作方法

1. BJ5183感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的質(zhì)粒（含有目標(biāo)基因并線性化）和腺病毒質(zhì)粒，并用手打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰中并靜置2分鐘，晃動會降低轉(zhuǎn)化效率。

3.向離心管中加入700 μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基 (2YT或LB)，混勻后37℃，200 rpm復(fù)蘇60分鐘。

4. 5000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。

5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)

1. 感受態(tài)細(xì)胞好在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過長，長時(shí)間

存放會降低轉(zhuǎn)化效率。

2. 混入目的DNA時(shí)應(yīng)輕柔操作。

3. BJ5183菌株的質(zhì)粒產(chǎn)量不高。腺病毒構(gòu)建成功后，可選擇在其他大腸桿菌菌株中擴(kuò)繁，純化質(zhì)粒。

4. BJ5183感受態(tài)細(xì)胞對溫度敏感，應(yīng)儲存在-80℃超低溫冰箱，避免溫度波動，溫度波動會降低感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率。