GV3101）感受態(tài)細胞

GV3101：                                                                  100μl/支
pCAMBIA2301（control vector，10ng/μl )                    10μl
保存條件(保質期)：                                         -80℃（12個月） 

基因型

C58 (rif^R) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gent^R) Nopaline

產品說明

GV3101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無自身轉運功能的胭脂堿型Ti質粒pMP90 (pTiC58DT-DNA)，此質粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pMP90 (pTiC58DT-DNA)質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 質粒含有篩選標簽：gent，賦予GV3101菌株慶大霉素抗性，適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉基因操作，本公司生產的GV3101化學轉化感受態(tài)細胞經特殊工藝制作，pCAMBIA2301質粒檢測轉化效率>10⁴ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 取-80℃保存的農桿菌感受態(tài)于室溫或手心片刻待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時插入冰中。

2.每100 μl感受態(tài)加入0.01-1 μg質粒DNA（轉化效率較高，一次使用前好做預實驗確定所加質粒的量），用手打管底混勻，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。

3. 加入700 μl無抗生素的LB或YEB液體培養(yǎng)基，于28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天

（當平板只含有50 μg/ml kan 時，28℃培養(yǎng)48 h即可；平板中同時加入50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 時，需28℃培養(yǎng)60 h；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90 h）。

注意事項

1. 加入質粒時體積不應大于感受態(tài)體積的1/10；質粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。

2. 混入質粒時應輕柔操作。轉化高濃度的質?？上鄳獪p少最終用于涂板的菌量。

3. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養(yǎng)不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應減少質粒用量。

4. 利福平濃度不應高于25 μg/ml，過高的利福平濃度不利于農桿菌生長，會降低其生長速度和轉化效率。本公司感受態(tài)計算轉化效率時所用平板只含有50 μg/ml kan，若所用平板含有20 μg/ml rif則轉化效率降低到1/2。

5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農桿菌；根據所用菌株抗性加入Ti質粒篩選抗生素可防止Ti質粒丟失，但Ti質粒篩選抗生素不利于農桿菌的轉基因操作，所以一般培養(yǎng)農桿菌時不考慮這些抗生素，Ti質粒丟失的概率極低(可以忽略)

1、農桿菌相關抗生素配方：

2、常用農桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）

3、LB及YEB配方：