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詳細(xì)介紹
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
LBA4404菌株為 Ach5型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽——利f平抗性基因 Rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此
菌株攜帶一無(wú)自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的章魚(yú)堿型 Ti 質(zhì)粒 pAL4404，此質(zhì)粒含有 vir 基因 (vir 基因是 T-DNA 插入
植物基因組必需的元件，pAL4404 質(zhì)粒自身的 T-DNA 轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體 T
DNA 順利轉(zhuǎn)移)。 pAL4404 型 Ti 質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽：Strep，賦予 LBA4404 菌株鏈m素抗性，適用于菸
草、番茄、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作。本公司開(kāi)發(fā)的 LBA4404 電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：
經(jīng) pCAMBIA2301 質(zhì)粒 (size:11633 bp)檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>105 cfu/μg DNA。
產(chǎn)品組成
組分
LBA4404
電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞
10 × 50μL
100 × 50μL
定制
基因型：Ach5 (RifR) Ti pAL4404 (StrepR) Octopine
存儲(chǔ)條件
-80 ℃保存；請(qǐng)勿將本品置于-20 ℃或者液氮中保存。
質(zhì)量控制
除章魚(yú)堿型 Ti 質(zhì)粒 pAL4404 外，無(wú)外源質(zhì)粒 DNA 殘留；
電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化效率≥105 cfu/μg DNA。
使用方法
1. 將新的 2 mm 電擊杯插入冰中預(yù)冷；或者將儲(chǔ)存于 75%乙醇中的 2 mm 電擊杯和杯蓋取出，在超凈工
作臺(tái)中將其倒置于干凈的吸水紙上，使乙醇充分揮發(fā)，然后插入冰中預(yù)冷；
2. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中待其融化，加入 0.01-1μg 質(zhì)粒 DNA（體積不大于 5μl），用 200
μl 槍頭將感受態(tài)-質(zhì)?；旌衔锟焖俎D(zhuǎn)移到預(yù)冷的電擊杯中，蓋上杯蓋；
3. 開(kāi)啟電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)（2500 V ，200 Ω，25μF），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成后快速插
入冰中，加入 900μl 無(wú)抗生素的 YEB 并將感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無(wú)菌空管中，28 ℃振蕩培養(yǎng) 2~3 小時(shí)。
（注：此電轉(zhuǎn)化參數(shù)為 Bio-rad 推薦，使用者也可使用電轉(zhuǎn)儀所推薦的 Protocol 進(jìn)行操作）
4. 6000 rpm 離心一分鐘收菌，留取 100μl 左右上清將菌體輕輕吹勻，并涂布于含相應(yīng)抗生素的 YEB 平板
上，倒置放于 28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 2~3 天（當(dāng)平板只含有 50μg/ml Kan 時(shí)，28℃培養(yǎng) 48 h 即可；平板中同時(shí)
加入 50μg/ml Kan，20μg/ml Rif 時(shí)，需 28℃培養(yǎng) 60h；如果使用的平板含有 50μg/ml Rif 時(shí)，則需要 28 ℃
培養(yǎng) 72~90 h）。
注意事項(xiàng)
1. 感受態(tài)細(xì)胞解凍后應(yīng)立即使用；
2. 加入的待轉(zhuǎn)化 DNA 的總體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的 1/10；
3. 利f平濃度不應(yīng)高于 25μg/μl，利f平濃度過(guò)高不利于農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，會(huì)降低其生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率；
4. 由于 Ti 質(zhì)粒丟失的概率極低（可以忽略），所以相關(guān)抗性基因可以不用添加
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