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陽離子脂質體的制備及細胞轉染

時間：2023/10/25閱讀：627
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設備及材料

  • 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺

  • 陽離子脂質

  • 氯仿

  • 蒸餾水

  • 緩沖

  • 帶聚四氟乙烯內襯的玻璃瓶

  • 玻璃注射器

  • 氮氣或氬氣

  • 真空系統(tǒng)

  • 0.22μm 過濾器（可選）

程序

  1. 將每種脂質成分（例如，DOTAP/DOPE）溶解在氯仿中至方便的工作濃度（1-10mg/mL）。

  2. 使用玻璃注射器將所需量的每種成分等分到玻璃瓶中。有關處理脂質有機溶液的更多信息。

  3. 全部混合玻璃瓶中的成分。

  4. 使用氮氣或氬氣流小心地蒸發(fā)氯仿（在充分通風的情況下）。

  5. 將脂質殘留物放在真空泵上 10-15 分鐘，以除去任何殘留的有機溶劑。

  6. 從真空泵中取出小瓶，并立即以最終脂質濃度的兩倍懸浮在蒸餾水中。

  7. 將脂質分散體超聲處理至澄清（2-5 分鐘）。

  8. 添加等體積的緩沖液（例如，308mM NaCl、40mM Hepes、pH7.4），并進一步超聲處理 2 分鐘。

  9. 溶液可通過 0.22μm 過濾器進行滅菌。

脂質/DNA 混合物的制備

  1. 將陽離子脂質分散體與 DNA（每 10μg 脂質 1μg）混合在合適的容器中。

  2. 將脂質/DNA 混合物孵育 5 分鐘。在室溫下。

  3. 5 分鐘后，混合物即可用于轉染細胞。

細胞轉染

  1. 用 HEPES 緩沖鹽水洗滌細胞單層兩次。

  2. 將細胞與脂質/DNA 混合物在 HEPES 緩沖鹽水（每 100 mm 培養(yǎng)皿 3 ml 混合物）中于 37°C 孵育 90 分鐘。

  3. 孵育期結束后，根據需要更換培養(yǎng)基或補充。

  4. 將細胞培養(yǎng)所需的時間并收獲。

筆記

  • DOPE:陽離子脂質的常見摩爾比為3:1和1:1。在某些情況下，全部由陽離子脂質組成的脂質系統(tǒng)已被用于轉染細胞。

  • 所引用的緩沖系統(tǒng)旨在用于體外使用，并不表明該系統(tǒng)可能適合體內使用。

參考

  • Leventis, R. 和 Silvius, JR (1990)。生物化學。生物物理學。Acta 1023：124-132。



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