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穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株

貨號(hào)：C10000

穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建

外源基因在細(xì)胞中的表達(dá)可分為兩大類(lèi)，一類(lèi)是瞬時(shí)表達(dá)，一類(lèi)是穩(wěn)定表達(dá)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，雖然可以達(dá)到高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天。后者外源DNA整合到宿主細(xì)胞染色體上，使宿主細(xì)胞可*表達(dá)目的基因。建立穩(wěn)定細(xì)胞株，一般是根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行篩選。抗性標(biāo)記基因有潮霉素（hygromycin）、新霉素（neomycin）和嘌呤霉素（puromycin），Hygromycin B、G418和puromycin進(jìn)行選擇性篩選。傳統(tǒng)的穩(wěn)定株篩選方法需要通過(guò)外源基因的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行篩選， 終獲得從單一細(xì)胞擴(kuò)增起來(lái)的穩(wěn)定細(xì)胞株， 該方法陽(yáng)性率低，周期長(zhǎng)，工作量大。慢病毒是一種RNA病毒，攜帶的外源基因在病毒感染細(xì)胞后需要逆轉(zhuǎn)錄為DNA，再整合到宿主細(xì)胞基因組以后才能表達(dá)。 利用慢病毒必須整合到宿主基因組的特性來(lái)篩選穩(wěn)定株的方法克服了傳統(tǒng)方法的弊端，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得高效率的穩(wěn)定細(xì)胞株。篩選得到的細(xì)胞或者可穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，用于蛋白的擴(kuò)增和富集；或者得到穩(wěn)定沉默特定基因的細(xì)胞株

1.需客戶(hù)告知目的基因具體信息，確定穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的類(lèi)型

2.提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)圖片、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、構(gòu)建完成的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系

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穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株

貨號(hào)：C10000

是一種經(jīng)過(guò)特定基因修飾的細(xì)胞株，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需表達(dá)外源基因、進(jìn)行基因敲除、敲入、以及精確改變基因序列（如點(diǎn)突變）。對(duì)比一般瞬轉(zhuǎn)方法，利用細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株開(kāi)展實(shí)驗(yàn)?zāi)軌颢@得長(zhǎng)期而穩(wěn)定的特定性狀，因此有助于增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株除了可用于基因調(diào)控研究，也非常適合于長(zhǎng)周期的藥物篩選和藥理學(xué)研究、重組蛋白和抗通過(guò)慢病毒系統(tǒng)或轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將外源基因表達(dá)框穩(wěn)定整合進(jìn)靶細(xì)胞基因組，實(shí)現(xiàn)外源基因在靶細(xì)胞的長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。對(duì)比瞬轉(zhuǎn)方法，構(gòu)建過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株可避免瞬轉(zhuǎn)中因轉(zhuǎn)染效率導(dǎo)致的表達(dá)效率不一致的問(wèn)題。構(gòu)建好的細(xì)胞株中的外源基因不會(huì)因?yàn)榧?xì)胞傳代而丟失，可以持續(xù)表達(dá)特定的基因或ncRNA序列用以基因功能研究，重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)不需要對(duì)細(xì)胞重新轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，大為節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。體生產(chǎn)等實(shí)驗(yàn)。載體家憑借其資源完備的載體定制平臺(tái)，通過(guò)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)常規(guī)腫瘤細(xì)胞的方式可構(gòu)建多種應(yīng)用類(lèi)型的細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

　　構(gòu)建CRISPR基因編輯細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株是當(dāng)今研究基因和細(xì)胞功能關(guān)系的流行工具。通過(guò)gRNA引導(dǎo)Cas9靶向靶細(xì)胞基因組特定序列的CRISPR基因編輯，如基因敲除、敲入和定點(diǎn)突變，可以從DNA水平修飾靶細(xì)胞的基因序列。載體家提供兩種gRNA表達(dá)模式，第一種是轉(zhuǎn)導(dǎo)gRNA/Cas9共表達(dá)載體，gRNA和Cas9在細(xì)胞株中同時(shí)表達(dá)。第二種是構(gòu)建Cas9表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求導(dǎo)入gRNA表達(dá)載體。使用單Cas9表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株可以獲得更大的實(shí)驗(yàn)靈活性，如導(dǎo)入多個(gè)gRNA打靶GOI，或者多個(gè)gRNA與多種Cas9（野生型Cas9, Cas9n, dCas9等）之間進(jìn)行搭配等。

　　CRISPR基因編輯系統(tǒng)可選擇單gRNA或雙gRNA表達(dá)方式。雙gRNA表達(dá)載體常用于以下需要兩個(gè)gRNA同時(shí)打靶的場(chǎng)景：1）雙gRNA引導(dǎo)兩個(gè)Cas9 nickase分別打靶靶位點(diǎn)的正反義DNA鏈，形成DSB并獲得比單gRNA更特異的打靶效果；2）通過(guò)在形成兩個(gè)DSB，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列的大片段刪除；3）同時(shí)打靶兩個(gè)不同的基因。雙gRNA表達(dá)載體由兩個(gè)U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gRNA的表達(dá)。

　　載體家CRISPR基因編輯載體可采用多類(lèi)方式進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞。除基因敲入和定點(diǎn)突變常用的gRNA瞬轉(zhuǎn)Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)株的方法外，我們還提供慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、PiggyBac轉(zhuǎn)座子載體等多種外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方式，以滿(mǎn)足體外或體內(nèi)多樣CRISPR基因編輯實(shí)驗(yàn)需求。

　　采用Tet-on系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)目的基因，雖然可以直接進(jìn)行質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)，但是載體家亦提供該類(lèi)載體的慢病毒包裝以構(gòu)建相關(guān)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。構(gòu)建好的Tet-On系統(tǒng)細(xì)胞株同時(shí)表達(dá)tTS和rtTA兩種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,而目的基因的表達(dá)可受四環(huán)素調(diào)控。其中tTS在四環(huán)素不存在的情況下會(huì)結(jié)合目的基因的上游TRE啟動(dòng)子，抑制目的基因表達(dá)。在細(xì)胞體系中添加四環(huán)素或其類(lèi)似物后，rtTA進(jìn)行響應(yīng)并結(jié)合TRE啟動(dòng)子，激活目的基因表達(dá)。

　　shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)株一般使用慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒在靶細(xì)胞基因組中導(dǎo)入shRNA表達(dá)框，實(shí)現(xiàn)shRNA在細(xì)胞系中的長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。不同于siRNA瞬轉(zhuǎn)，shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)株可內(nèi)源性地穩(wěn)定表達(dá)siRNA效果，不受轉(zhuǎn)染效率影響，從而獲得更穩(wěn)定的基因敲低效果。