T7pLysY大腸桿菌表達 感 返回列表頁

T7pLysY 大腸桿菌表達感受態(tài)細胞
產(chǎn)品信息：
組成 BC207-01 BC207-02
T7pLysY Competent cells 10×100μl 20×100μl
pUC19（0.1ng/μl） 5μl 5μl
儲存條件：-70℃保存，避免反復(fù)凍融。
產(chǎn)品說明：
T7pLysY 菌株為大腸桿菌 BL21 增強型菌株，為 Lon 和 OmpT 蛋白酶缺陷型，用于毒性或非毒性蛋白的表
達。該菌株區(qū)別于 BL21(DE3)pLysS 和 BL21(DE3)pLysE 菌株的優(yōu)勢在于 T7 RNA 聚合酶基因整合在細菌染色
體上的 lac操縱子區(qū)域，基因組中無λ前噬菌體序列，LysY 表達的 T7 保留了對 T7 RNA 聚合酶的抑制作
用但缺失了水解細胞壁的酰胺酶活性，有利于降低基因的背景表達和避免誘導(dǎo)過程中細菌的裂解，菌株具有抗
T1 噬菌體感染等特點。T7pLysY 表達感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19 質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率大于 108 cfu/μg。
基因型：
fhuA2lacZ::T7gene1[lon]ompTgalsulA11R(mcr-73::miniTn10--TetS )2[dcm]R(zgb-210::Tn10--TetS )endA1D(mcr
C-mrr)114::IS10 lysY (CamR )
菌株抗性：對氨芐，，，和四環(huán)素敏感，對有抗性。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化步驟：
1. 將感受態(tài)細胞置于冰水浴中化凍。待細胞剛化凍后，加入質(zhì)粒DNA 到細胞中，用手指管底，輕
輕混勻；
2. 冰水浴中放置15-30 分鐘，不要晃動；
3. 42℃熱擊 60 秒鐘，不要晃動；
4. 冰水浴中放置2 分鐘，不要晃動；
5. 加入 500μl 無菌的 SOC 或 LB 培養(yǎng)基；
6. 置于 37℃搖床中，150-200rpm 震蕩復(fù)蘇培養(yǎng) 60 分鐘；
7. 取 50-100μl 菌液涂布在含 34µg/ml 及所選質(zhì)粒篩選抗生素的 LB 平板上。待液體吸干后，倒置
平板，37℃培養(yǎng) 12-16 小時。
（平板劃線分離法：復(fù)蘇培養(yǎng)結(jié)束后，12000rpm 離心 30 秒鐘，棄掉上清，留 100μl 左右的液體，用 200μl 吸
頭輕輕吹打散菌塊，取 10μl 重懸的菌液分多點滴在抗性 LB 平板上，傾斜吸頭，用吸頭頭部的側(cè)面將滴在
平板上的液體來回劃線。37℃培養(yǎng)過夜。這個方法可以獲得更多更大的單克隆菌落。）
蛋白表達步驟：
1. 挑取單菌落，接種到5ml 含34µg/ml 及所選質(zhì)粒篩選抗生素的LB 培養(yǎng)基中。
2. 37℃，200rpm 震蕩培養(yǎng)細菌至對數(shù)生長期（OD600=0.4-0.8）。
3. 加入 IPTG 到終濃度為 0.4mM，37℃誘導(dǎo) 2-4 小時或 16℃誘導(dǎo)過夜。
4. 誘導(dǎo)完成后，離心收集菌體，用合適的方法（如考馬斯亮藍染膠法，Western-Blot法或酶活性分析法）
分析菌體裂解物的總蛋白、上清和沉淀組分，明確表達產(chǎn)物的表達狀況（可溶性或不溶性表達）。
5. 大量表達時，可用 10ml 過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到 1L 培養(yǎng)基中，當(dāng)培養(yǎng)到 OD600=0.4-0.8 時，加入終濃度為
0.4mM的 IPTG，37℃誘導(dǎo) 2-4 小時或 16℃誘導(dǎo)過夜（不同蛋白表達的條件有所不同，需在實驗中
優(yōu)化）。


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重組蛋白：多項發(fā)明，原核表達系統(tǒng)穩(wěn)定表達蛋白 1000 余種。


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