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EHA105 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品信息：

組成 BC303-01
EHA105 Chemically Competent Cell 20×100μl
pCAMBIA2301（100ng/μl） 1 支
儲(chǔ)存條件：-70℃保存，避免反復(fù)凍融。
基因型：
C58 (rif R ) Ti pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) (strep R ) Succinamopine
產(chǎn)品介紹：
EHA105 菌株由 EHA101 菌株改造而來(lái)，為 C58 型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽——抗性基因 Rif，
為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無(wú)自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的琥珀堿型 Ti 質(zhì)粒 pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) ，此質(zhì)粒
含有 vir 基因（vir 基因是 T-DNA 插入植物基因組必需的元件，pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒自身的
T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體 T-DNA 順利轉(zhuǎn)移）。pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)
Ti 質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽：Strep，賦予 EHA105 菌株抗性，適用于水稻、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作經(jīng)植物
雙元pCAMBIA2301 質(zhì)粒檢測(cè)，轉(zhuǎn)化效率可達(dá) 10 3 cfu/μg，-70℃保存 12 個(gè)月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。
轉(zhuǎn)化方法（采用凍融方法）
1. 取-70℃保存的 EHA105 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞于冰水浴中融化；
2. 無(wú)菌條件下，向感受態(tài)細(xì)胞中加入 100ng-1μg 質(zhì)粒 DNA（次使用前做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定所加質(zhì)粒的
量），輕輕混勻，冰水浴中靜置 5 分鐘；
3. 將離心管置于液氮中速凍 5 分鐘；（注：也可以用干冰和無(wú)水乙醇混合物代替液氮）
4. 然后快速將離心管置于 37℃水浴中保持 5 分鐘，不要晃動(dòng)水面；
5. 將離心管放回冰水浴中，冰浴 5 分鐘；
6. 無(wú)菌條件下加入 800μl 無(wú)抗生素的 2xYT 或 LB 液體培養(yǎng)基，于 28℃振蕩培養(yǎng) 2-3 小時(shí)，菌體復(fù)蘇；
7. 6000rpm 離心 1 分鐘收菌，留 100μl 左右上清，輕輕吹打重懸菌體，取適量菌液，涂布于相應(yīng)抗生素的
LB 平板上，于 28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 48-72 小時(shí)。
（當(dāng)平板只含有 50 μg/ml Kan 時(shí)，28℃培養(yǎng) 48 h 即可；平板中同時(shí)加入 50 μg/ml Kan，20 μg/ml Rif 時(shí)，需 28℃
培養(yǎng) 60 h；如果使用的平板含有 50 μg/ml Rif 則需要 28℃培養(yǎng) 72-90 h）。
注意事項(xiàng)
1. 加入質(zhì)粒時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的 1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；
質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。
2. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。
3. 平板上陽(yáng)性克隆密度過(guò)大時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)不足，陽(yáng)性克隆生長(zhǎng)變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應(yīng)
減少質(zhì)粒用量。
4. 濃度不應(yīng)高于 25 μg/ml，過(guò)高的濃度不利于農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，會(huì)降低其生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率。
5. 培養(yǎng)基中加入的目的是防止雜菌生長(zhǎng)、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入 Ti 質(zhì)粒篩選抗生素
可防止 Ti 質(zhì)粒丟失，但 Ti 質(zhì)粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時(shí)不考慮
這些抗生素，Ti 質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略)。


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重組蛋白：多項(xiàng)發(fā)明，原核表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定表達(dá)蛋白 1000 余種。


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