K1-Fluo 激光共聚焦顯微鏡在細(xì)胞骨架研究中的應(yīng)用

隨著生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)觀察細(xì)胞形態(tài)所使用的儀器精度也越來越高，激光共聚焦顯微鏡具有高靈敏度，高分辨率，高放大率等優(yōu)點(diǎn)，而且它不但可以在水平方向上對(duì)標(biāo)本進(jìn)行測(cè)量和分析，還可以獲得清晰的三維圖像。同時(shí)它還可以處理活的樣品，不會(huì)對(duì)樣品造成化學(xué)或物理破壞，因此它在形態(tài)學(xué)，分子細(xì)胞生物學(xué)，神經(jīng)科學(xué)，藥理學(xué)，遺傳學(xué)等研究領(lǐng)域中成為有力的工具。

K1-Fluo 激光共聚焦顯微鏡的介紹

共聚焦顯微鏡的原理

K1-Fluo ABM 是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置，使用405nm ,488nm , 561nm , 638nm波長(zhǎng)的激光作為光源，并利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，獲得高分辨率，高質(zhì)量的圖像。K1-Fluo ABM 主要由激光發(fā)射器，掃描器，熒光顯微鏡，計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器以及處理和控制系統(tǒng)組成。通過針孔成像技術(shù)還可以對(duì)樣品進(jìn)行無損傷斷層掃描，并且利用自帶的軟件自動(dòng)進(jìn)行三維重構(gòu)。

由于K1-Fluo 采用針孔共聚焦技術(shù)，在物鏡的焦平面上放置了一個(gè)帶有小孔的擋板，可以將焦平面以外的雜散光擋住，消除球差，并進(jìn)一步消除色差。

傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡使用的是場(chǎng)光源，標(biāo)本上每一點(diǎn)的圖像都會(huì)受到鄰近點(diǎn)的衍射的干擾，激光共聚焦顯微鏡采用點(diǎn)掃描技術(shù)，激光束經(jīng)照明針孔形成點(diǎn)光源對(duì)焦平面上進(jìn)行逐點(diǎn)掃描，標(biāo)本上被照射的熒光在探測(cè)針孔處成像，該點(diǎn)以外的熒光均被探測(cè)針孔擋住，因此大大提高了清晰度。在物鏡轉(zhuǎn)臺(tái)上裝上步進(jìn)馬達(dá)，就可以控制物鏡上下移動(dòng)，就可以獲得一張紙連續(xù)的光學(xué)切片，在利用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)行三維重建。

與此同時(shí)LSCM也是觀察活細(xì)胞動(dòng)態(tài)、多重免疫熒光標(biāo)記和離子熒光標(biāo)記的有力工具。

K1-FluoDMB激光共聚焦顯微鏡的應(yīng)用案例

微絲（MF），又稱肌動(dòng)蛋白，是真核細(xì)胞中由肌動(dòng)蛋白組成的高度動(dòng)態(tài)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其參與細(xì)胞內(nèi)多種生理活動(dòng)，如細(xì)胞質(zhì)流動(dòng)、細(xì)胞分裂、細(xì)胞顆粒的運(yùn)輸、肌肉收縮等等。細(xì)胞骨架通常是通過迅速的聚合解聚來調(diào)整或改變其形態(tài)，從而在細(xì)胞中開展各種功能以及應(yīng)對(duì)外界刺激時(shí)維持細(xì)胞正常的生理活動(dòng)。細(xì)胞中微絲骨架的動(dòng)態(tài)變化直接接受肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（ABPs）的調(diào)節(jié)。ABPs通過與單體肌動(dòng)蛋白或絲狀肌動(dòng)蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)二者之間的動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)而調(diào)控微絲骨架的組織和功能。通過采用探針標(biāo)記對(duì)體內(nèi)的微絲骨架進(jìn)行標(biāo)記再利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行激發(fā)熒光可以獲得可視化的圖像。正是由于發(fā)光探針結(jié)合激光共聚焦顯微鏡的使用，才使得對(duì)于細(xì)胞骨架的系統(tǒng)性研究越來越透徹，從而一步步揭開細(xì)胞骨架的奧秘。

1.細(xì)胞觀察

結(jié)論：

通過多篇文獻(xiàn)的反映，激光熒光共聚焦顯微鏡呈現(xiàn)一系列的優(yōu)點(diǎn)，比如：高清晰，高分辨率圖像的采集，無損傷連續(xù)光學(xué)切片的采集，三維圖像的重建，對(duì)感興趣區(qū)域的掃描，定位，測(cè)量等。

通過激光共聚焦顯微鏡可以獲得豐富的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，有利于支持實(shí)驗(yàn)研究，而K1-Fluo自帶的分析軟件還可以對(duì)樣品進(jìn)行最直觀的分析。

總而言之，我們相信，LSCM 可以開拓生命科學(xué)實(shí)時(shí)觀察活細(xì)胞的機(jī)構(gòu)和離子動(dòng)態(tài)生物學(xué)變化的途徑，隨著新軟件的不斷開發(fā)以及各個(gè)學(xué)科的不斷發(fā)展和滲透，為了CLSM 必將由更廣闊的發(fā)展前景。