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準(zhǔn)確定量分析基因治療制劑中轉(zhuǎn)染劑聚乙烯亞胺（PEI）殘留
生物制藥領(lǐng)域的浪潮，從單抗、雙抗、ADC 等抗體藥物的研發(fā)拓展到基因治療和細(xì)胞治療，以及現(xiàn)在異常火熱的 mRNA 疫苗領(lǐng)域和寡核苷酸藥物等。
聚乙烯亞胺（PEI）是一類陽離子聚合物轉(zhuǎn)染載體，在基因治療方法開發(fā)與生產(chǎn)中，可通過瞬時(shí)基因表達(dá)生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，還可以在貼壁細(xì)胞系中用于病毒載體生產(chǎn)（腺相關(guān)病毒、慢病毒、腺病毒等）。具有基因轉(zhuǎn)染效率高，易于從溶酶體中逃逸等優(yōu)點(diǎn)。但是 PEI 具有一定的毒性，其不易在體內(nèi)生物降解的缺點(diǎn)受到了研發(fā)人員的關(guān)注，因此大家會嚴(yán)格控制 PEI 在基因治療制劑中的殘留，將潛在的風(fēng)險(xiǎn)降到低。為了滿足大家對 PEI 痕量殘留監(jiān)控的急切需求，我們開發(fā)了 HPLC-ELSD 方法準(zhǔn)確定量分析制劑中轉(zhuǎn)染劑 PEI 的殘留。
什么是 PEI？
PEI 是水溶性高分子聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，沒有顯著的紫外吸收的基團(tuán)，且?guī)в写罅康恼姾??；诖颂匦裕步輦愅瞥鲆合嗌V-蒸發(fā)光散射（HPLC-ELSD）聯(lián)用技術(shù)，適用于分析無法通過紫外檢測器進(jìn)行測定的半揮發(fā)性及非揮發(fā)性化合物，特別是對于缺乏紫外吸收基團(tuán)且不易揮發(fā)的 PEI 有較高的靈敏度和較好的重現(xiàn)性。
實(shí)驗(yàn)樣品分析
準(zhǔn)備 PEI 的對照品溶液，可以看到不同分子量的 PEI(PEI-25kDa和PEI-40kDa)在安捷倫 Poroshell HPH-C18 色譜柱上均有較好的保留。
圖 1 不同分子量 PEI 的色譜圖
PEI 為了準(zhǔn)確定量實(shí)際樣品溶液中 PEI 的殘留，我們配制了一系列不同濃度的 PEI 對照品溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖 2 一系列不同濃度的 PEI 色譜圖
圖 3 PEI 標(biāo)準(zhǔn)曲線（濃度范圍 0.01-0.1 mg/mL）
在此色譜條件下，PEI 在 ELSD 檢測器上有較高的靈敏度，濃度 0.001 mg/mL，可以得到 S/N=42，*測定制劑中痕量 PEI 殘留的要求。
圖 4 濃度 0.001 mg/mL PEI 的色譜圖
在實(shí)際樣品分析過程中，制劑中含量較高的緩沖鹽，以及前處理后殘留的其他物質(zhì)在色譜柱上沒有保留，在死時(shí)間出峰，而 PEI 與色譜柱具有較強(qiáng)的作用力，通過快速的有機(jī)溶劑梯度變化進(jìn)行洗脫，可以得到很好的分離，PEI 的加標(biāo)回收率在 90%-110%之間。
圖 5 實(shí)際樣品及加標(biāo)樣品色譜圖
該方法分離度好，靈敏度高，具有良好的線性關(guān)系、精密度和準(zhǔn)確度，保留時(shí)間和峰面積的 RSD 分別在 0.1%和 1.6%范圍內(nèi)。
利用上面的 HPLC-ELSD 分析方法，可以很好地滿足目前對制劑中痕量 PEI 殘留的分析，同時(shí)考慮到實(shí)際樣品基質(zhì)比較復(fù)雜，在色譜柱之后和 ELSD 之前，安裝多功能閥，通過軟件設(shè)置切換時(shí)間，將 4min 之前高濃度基質(zhì)切換到廢液中，4min 之后待測 PEI 切到 ELSD 中進(jìn)行檢測。既準(zhǔn)確測定了痕量 PEI，又避免了基質(zhì)污染 ELSD 檢測器，保證了該方法的重現(xiàn)性。
推薦儀器
HPLC-ELSD 聯(lián)用技術(shù)采用全新 1290 Infinity II ELSD 檢測器，包括特殊光電倍增管以及激光器件，使其在靈敏度提高的同時(shí)，動態(tài)范圍提高 90 倍，而且其*的高精度玻璃噴頭設(shè)計(jì)為峰面積重現(xiàn)性提供了保證。
液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器
出色的靈敏度
新的 1290 Infinity II ELSD 檢測器配置性能出眾的激光光源，靈敏度比常規(guī) ELSD 高出 10 倍，更適用于痕量分析。
極佳的穩(wěn)定性
經(jīng)過優(yōu)化的安捷倫 ELSD 檢測器具有出色的穩(wěn)定性，使大部分分析物獲得優(yōu)異的重現(xiàn)性，提供可靠、準(zhǔn)確的分析結(jié)果。
結(jié)語
與此同時(shí)，為滿足國內(nèi)迅速發(fā)展的生物制藥行業(yè)對輔料、工藝殘留和遞送載體等分析提出的更高要求，安捷倫應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室開發(fā)出一系列解決方案，包括 mRNA 疫苗和寡核苷酸藥物遞送載體的分析，治療性蛋白藥物制劑中表面活性劑吐溫 20 或吐溫 80 、穩(wěn)定劑泊洛沙姆 188、凍干保護(hù)劑蔗糖、氨基酸等輔料成份的分析；以及消泡劑（二甲基硅油）和裂解劑（Triton X-100）等生產(chǎn)工藝殘留分析。
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1 采用 Agilent 1290 Infinity II ELSD 同時(shí)定量分析治療性蛋白藥物制劑中吐溫 80 （聚山梨酯 80）和泊洛沙姆 188
2 使用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器 (HPLC-ELSD) 對生物制劑中的泊洛沙姆 188 進(jìn)行定量分析
3 安捷倫生物制藥輔料及生產(chǎn)工藝殘留分析解決方案
4 使用反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法 (RP-HPLC-ELSD) 對 PEG 偶聯(lián)重組蛋白注射劑中的吐溫 20（聚山梨酯 20）進(jìn)行分析