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藥用輔料分析與質(zhì)量控制 | LC-Q/TOF結(jié)合PolymerStudio 軟件進(jìn)行吐溫成分精細(xì)表征和對(duì)比研究
聚山梨酯，商品名吐溫，親水性和化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)，添加到藥物制劑中，可提高活性成分的溶解度，或者通過(guò)抑制大分子蛋白藥物的自行聚集來(lái)提高蛋白藥物的穩(wěn)定性。目前抗體制劑配方中，吐溫 20 和吐溫 80 是常用的表面活性劑類輔料。
理論上，吐溫是脫水山梨醇聚氧乙烯與脂肪酸的單酯化產(chǎn)物，其中吐溫 80 主要成分為油酸酯，而吐溫 20 中有月桂酸酯和肉豆蔻酸酯等多種脂肪酸酯成分，吐溫 20 和吐溫 80 的理論聚合度均為 20（結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖 1）。而實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中，吐溫合成要經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的聚合反應(yīng)，因而吐溫產(chǎn)品本身是一系列組分的混合物。有報(bào)道稱，吐溫中的某些組分，如聚氧乙烯異山梨醇酐一油酸酯（PIM），可能與注射劑的不良反應(yīng)有關(guān)。生物制劑中，在緩沖溶液的 pH 值、金屬離子、活性酶等影響下，吐溫可能發(fā)生氧化和水解等降解反應(yīng)。吐溫降解不僅會(huì)造成吐溫含量的降低，還會(huì)產(chǎn)生游離脂肪酸，可能導(dǎo)致生物制劑中出現(xiàn)不溶性微粒等問(wèn)題，從而對(duì)藥品的安全性和有效性造成深遠(yuǎn)的影響。
為了更好地評(píng)估吐溫質(zhì)量和更早地發(fā)現(xiàn)制劑中吐溫成分的變化，我們開發(fā)了一種基于 LC-Q/TOF AIM 模式分析吐溫成分的方法。該方法結(jié)合 PolymerStudio 藥用輔料智能分析軟件，無(wú)需專業(yè)質(zhì)譜經(jīng)驗(yàn)，即可實(shí)現(xiàn)吐溫組成成分的自動(dòng)化表征。為吐溫精細(xì)結(jié)構(gòu)分析和組成成分的深入探究，以及不同輔料間的比較分析，提供高效便捷和靈敏可靠的分析方法。
圖 1. 吐溫 20 和 吐溫 80 的理論結(jié)構(gòu)
實(shí)驗(yàn)采用反相色譜法，經(jīng)過(guò)前期色譜柱的篩選和流動(dòng)相的優(yōu)化，使吐溫 20/40/60/80 中的各成分按照不同的結(jié)構(gòu)和聚合度進(jìn)行初步分離，再結(jié)合高分辨質(zhì)譜進(jìn)行表征。在此基礎(chǔ)上，研究者探索了吐溫中的理論成分，建立了保留時(shí)間數(shù)學(xué)模型，確認(rèn)了不同成分的特征碎片離子，并開發(fā)了 PolymerStudio 藥用輔料智能分析系統(tǒng)，用于自動(dòng)解析聚合型輔料的質(zhì)譜信息。實(shí)驗(yàn)人員僅需要按照 SOP 方法處理樣品并采集 LC-Q/TOF 數(shù)據(jù)，在 PolymerStudio 軟件中調(diào)用適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)庫(kù)，并簡(jiǎn)單設(shè)置參數(shù)，即可實(shí)現(xiàn)吐溫類樣品成分的自動(dòng)化表征，并可進(jìn)行樣品間的對(duì)比研究。吐溫輔料樣品稀釋后直接檢測(cè)。大分子制劑可采用乙腈沉淀去除蛋白后再檢測(cè)，如需濃縮，建議氮吹后復(fù)溶。具體實(shí)驗(yàn)條件參考前篇推送（見(jiàn)文末推薦閱讀篇）。
圖 2 展示了某吐溫 20 樣本的 TIC 色譜圖及軟件分析結(jié)果。結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的吐溫組分，如聚氧乙烯（POE）、聚氧乙烯脫水山梨醇（PS）、聚氧乙烯異脫水山梨醇（PI），不同聚合度的化合物在色譜中有適度分離；稍微復(fù)雜一些的單酯，不同母核及脂肪酸酯的組分可以得到分離；對(duì)于二酯、三酯、四酯等高酯化組分，色譜層面難以完全分離，但可以觀察到保留時(shí)間變化的趨勢(shì)。軟件會(huì)利用加合離子、質(zhì)量偏差、特征碎片等信息，詳細(xì)分析每一種可能的成分及相對(duì)含量（精確到不同聚合度的每一個(gè)化合物），并根據(jù)不同樣品特點(diǎn)和統(tǒng)計(jì)需求，計(jì)算出整合后的結(jié)果，如不同亞類成分的相對(duì)含量、樣品平均聚合度和酯化度等。
圖 2. 吐溫 20 的成分表征（TIC 色譜圖及組分標(biāo)識(shí)）
在每個(gè)吐溫樣品精細(xì)表征定性分析的基礎(chǔ)上，也可對(duì)不同吐溫樣品進(jìn)行組成成分的相對(duì)定量和對(duì)比分析。這種對(duì)比研究可用于不同廠家或者同一廠家不同批次的吐溫原料比較，也適用于吐溫降解通路的分析研究。
我們對(duì)蛋白制劑中的吐溫 20 加速降解進(jìn)行了研究。從組成成分的精細(xì)表征結(jié)果看，辛酸單酯、癸酸單酯和月桂酸單酯的含量變化較小，肉豆蔻酸單酯和月桂酸單酯，油酸單酯的含量隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而明顯降低。雙酯及更高酯化度的化合物，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，信號(hào)強(qiáng)度明顯減小甚至消失。下表展示了部分成分，包括未酯化成分和月桂酸酯的含量變化，聚氧乙烯（POE）、聚氧乙烯異脫水山梨醇（PS）、聚氧乙烯單月桂酸酯（PML）、聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯（PSML）、聚氧乙烯異脫水山梨醇單月桂酸酯（PIML）相對(duì)含量增加，而聚氧乙烯脫水山梨醇雙月桂酸酯（PSDL）、聚氧乙烯脫水山梨醇三月桂酸酯（PSTL）、聚氧乙烯脫水山梨醇四月桂酸酯（PSEL）、聚氧乙烯異脫水山梨醇雙月桂酸酯（PIDL）等高酯化物相對(duì)含量明顯降低，甚至無(wú)法檢出。
安捷倫與科邁恩以及中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所共同推廣的 UHPLC-6500 系列 Q-TOF MS 結(jié)合 PolymerStudio 聚合物分析軟件的一體化解決方案，幫助解決了藥用輔料質(zhì)量研究和質(zhì)量控制中的挑戰(zhàn)，加快了藥物制劑開發(fā)的進(jìn)程，是制劑處方篩選與工藝優(yōu)化過(guò)程中分析工作的有力武器。