慢病毒載體生產(chǎn)應用及慢病毒轉染原理詳解 -賽默飛

最大限度提高滴度的慢病毒載體生產(chǎn)可擴展解決方案 

無論您采用貼壁系統(tǒng)還是從事懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)，病毒生產(chǎn)都會是您整體運營過程中價格不菲的一環(huán)。我們的目標是最大限度提高滴度，為您的病毒生產(chǎn)提供高性價比的可擴展解決方案。 

我們致力于助力客戶取得商業(yè)化成功，這也是我們不斷開發(fā)新的解決方案，不斷幫助您走在細胞和基因治療的根本原因。 

賽默飛提供慢病毒載體相關產(chǎn)品，請訪問獲取產(chǎn)品最新信息。 

針對懸浮培養(yǎng)慢病毒生產(chǎn)進行了優(yōu)化 

· Gibco LV-MAX 慢病毒生產(chǎn)體系 

· 高滴度—超過1 x 108 TU/mL （未濃縮的LVVs-GFP） 

· 可擴展的懸浮培養(yǎng)體系—規(guī)格可從96孔深孔板擴展到2L生物反應器 

· 無血清—消除了動物源成份及相關的風險 

· GMP積極開發(fā)計劃 

Gibco LV-MAX 慢病毒生產(chǎn)體系是針對化學成分明確的無血清環(huán)境下的懸浮培養(yǎng)慢病毒生產(chǎn)進行過優(yōu)化，包含最大限度提高生產(chǎn)所需的所有高質量成份的系統(tǒng)。? 

為改進慢病毒生產(chǎn)而優(yōu)化的多成份體系 

LV-MAX 慢病毒生產(chǎn)體系可提供可擴展、高產(chǎn)量的慢病毒載體生產(chǎn)平臺。其基于在LV-MAX生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的HEK 293來源的病毒生產(chǎn)細胞高密度培養(yǎng)物。通過我們先進的脂質體納米微粒 轉染試劑結合新型的慢病毒特異性增強劑和添加劑（圖1），調控實現(xiàn)最佳的慢病毒滴滴度。所有成份協(xié)同作用，相對于傳統(tǒng)的聚乙烯亞胺(PEI)血清培養(yǎng)體系，有助于生成更優(yōu)良的功能性慢病毒微粒（圖2）。上述數(shù)據(jù)證明，相對于使用未經(jīng)優(yōu)化的系統(tǒng)，我們的完整體系在提高慢病毒載體(LVV)方面的突出積極影響（圖3）。 

圖 1.LV-MAX 慢病毒生產(chǎn)體系實驗方案概覽 

圖 2：采用LV-MAX體系的病毒滴度顯著提高采用我們的LV-MAX慢病毒生產(chǎn)體系或替代轉染試劑和細胞，在30 mL搖瓶之中生產(chǎn)慢病毒。LV293 = Gibco 病毒生產(chǎn)細胞（HEK 293來源的懸浮細胞），293F = Gibco FreeStyle 293-F細胞系，PEI = 聚乙烯亞胺。 

以更低的成本實現(xiàn)更高產(chǎn)量的慢病毒生產(chǎn) 

相對于基于PEI的系統(tǒng)，LV-MAX體系的貼壁細胞慢病毒產(chǎn)量提高近15倍，懸浮細胞慢病毒產(chǎn)量提高近10倍，且成本下降了50%以上。 

圖 3.采用LV-MAX慢病毒生產(chǎn)體系，慢病毒產(chǎn)量大幅提升。采用LV-MAX慢病毒生產(chǎn)體系的懸浮細胞慢病毒產(chǎn)量（未過濾）與采用PEI介導的慢病毒載體轉染方法的貼壁HEK 293T/FT 細胞和懸浮HEK293細胞慢病毒產(chǎn)量比較。通過轉導HT1080細胞并分析GFP陽性細胞進行慢病毒滴度測定。同時展示了帶來的成本節(jié)省情況。 

更自信地規(guī)?；瘮U展 

LV-MAX慢病毒生產(chǎn)體系支持在不同的懸浮培養(yǎng)皿中進行穩(wěn)定的慢病毒生產(chǎn)。您可以根據(jù)自己在發(fā)現(xiàn)研究早期的需要擴大或縮小自己的規(guī)模以實現(xiàn)更高的通量，亦可在維持無血清體系高產(chǎn)量的前提下無縫、高效規(guī)?；瘮U展（圖4）。無論何種規(guī)模，您均可更自信地開展生產(chǎn)。 

圖 4.LV-MAX慢病毒生產(chǎn)體系在HEK 293來源的懸浮細胞之中的可擴展性。采用LV-MAX 慢病毒生產(chǎn)體系，通過96孔深孔板到2 L生物反應器，進行不同體積的慢病毒生產(chǎn)。通過轉導HT1080細胞并分析GFP陽性細胞，測定慢病毒滴度；在不同體積規(guī)格下，觀測到了相似的滴度。 

可實現(xiàn)出色的貼壁培養(yǎng)慢病毒生產(chǎn)的先進脂質體納米微粒技術 

Invitrogen Lipofectamine 3000轉染試劑是高效、高性價比的慢病毒生產(chǎn)工具。即便是較大或難以包裝的基因，通過這種多功能試劑亦可實現(xiàn)高病毒滴度。 

Invitrogen Lipofectamine 3000試劑 

· 高滴度—涵蓋了較大或難以包裝的基因 

· 作用溫和—減少了試劑用量，提高了細胞活力 

· 靈活—與我們現(xiàn)有的實驗方案兼容 

· 性價比高—所需的輔助試劑和人力成本更少 

Lipofectamine 3000試劑、Lipofectamine 2000試劑和PEI的平行比較結果顯示，Lipofectamine 3000試劑介導的慢病毒生產(chǎn)產(chǎn)量相對于其他轉染試劑提高了約5–10倍（圖5）。 

圖 5.采用Lipofectamine 3000試劑進行的貼壁細胞慢病毒生產(chǎn)。分別將Lipofectamine 3000試劑、Lipofectamine 2000試劑和PEI加入到含HEK 293T/FT細胞的6孔培養(yǎng)板中，獲得pLenti6.3/V5-GW/EmGFP和Invitrogen ViraPower慢病毒包裝混合物。轉導HT1080細胞并分析GFP陽性細胞，測定慢病毒滴度。 

病毒轉染原理及步驟 

對于不適合脂質體介導轉染的細胞類型，通常使用病毒載體進行轉染。病毒介導轉染也稱為轉導，這種轉染方式可在難以轉染的細胞類型中實現(xiàn)蛋白過表達或敲低，是臨床研究中的方法（Glover 等人，2005；Pfeifer 和 Verma，2001）。腺病毒、致癌逆轉錄病毒和慢病毒載體已廣泛用于哺乳動物細胞培養(yǎng)物和體內的基因遞送。病毒基因轉移的其他示例包括基于桿狀病毒和牛痘病毒的載體。有關各種病毒遞送系統(tǒng)的更多信息，請參見病毒載體。 

雖然病毒能整合到宿主基因組中，體內轉染效率高且能持續(xù)基因表達，因而成為臨床試驗中基因遞送的系統(tǒng)，但也存在許多缺點，包括其免疫原性和細胞毒性、載體方面存在技術挑戰(zhàn)且生產(chǎn)程序耗時費力、生物安全要求導致高成本、低包裝能力（大多數(shù)病毒載體約為 10 kb，而非病毒載體約為 100 kb）以及病毒載體制劑的感染性存在變異性（Glover 等人，2005；Kim 和 Eberwine，2010；Vorburger 和 Hunt，2002） 

典型的轉導方案涉及改造攜帶轉基因的重組病毒、在包裝細胞系中擴增重組病毒顆粒、純化和滴定擴增后的病毒顆粒以及隨后感染目標細胞。雖然在原代細胞和細胞系中實現(xiàn)的轉導效率相當高（約為 90%-100%），但只有攜帶病毒特異性受體的細胞才能被病毒感染。同樣重要的是應注意，用于病毒擴增的包裝細胞系需要用非病毒轉染方法轉染。 

病毒遞送操作流程 

步驟一：生成病毒 

通過基因克隆生成重組病毒。 

步驟二：非病毒轉染 

使用非病毒方法轉染包裝細胞系以擴增和分離病毒載體。 

步驟三：病毒純化 

純化并滴定含轉基因的病毒載體。 

步驟四：感染和病毒清除 

以適當?shù)母腥緩蛿?shù) (MOI) 感染目標細胞（含病毒特異性受體）。 

從培養(yǎng)物中去除病毒和/或加入新鮮培養(yǎng)基。 

步驟五：檢測細胞 

檢測轉導后細胞的基因表達或沉默情況。 

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