細(xì)胞傳代培養(yǎng)步驟全流程指南與關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)解析 -賽默飛

什么是細(xì)胞傳代培養(yǎng)？ 

細(xì)胞傳代培養(yǎng)，也稱為細(xì)胞傳代，是指將培養(yǎng)基移除并將細(xì)胞從之前的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新鮮的生長培養(yǎng)基中的過程。這一程序使得細(xì)胞系或細(xì)胞株能夠進(jìn)一步增殖和維持。 

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培養(yǎng)細(xì)胞生長模式的特征 

培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞生長遵循標(biāo)準(zhǔn)模式。接種后會(huì)有一段停滯期，隨后是指數(shù)生長階段（稱為對(duì)數(shù)期）。 當(dāng)貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞占滿了所有可用的基質(zhì)并且沒有空間繼續(xù)擴(kuò)展，或者當(dāng)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞超過了培養(yǎng)基支持進(jìn)一步生長的能力時(shí)，細(xì)胞增殖會(huì)大幅減少或停止（參見下圖1）。當(dāng)細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿或細(xì)胞密度超過培養(yǎng)基的承載能力時(shí)，應(yīng)該對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代或亞培養(yǎng)。這能讓細(xì)胞保持在最佳密度以促進(jìn)持續(xù)生長，并刺激進(jìn)一步的增殖。維持對(duì)數(shù)生長期的增長將盡可能增加實(shí)驗(yàn)的健康細(xì)胞數(shù)量。 

圖 1：培養(yǎng)細(xì)胞生長模式的特征。 半對(duì)數(shù)圖形顯示了細(xì)胞培養(yǎng)密度對(duì)培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系。 培養(yǎng)基中的細(xì)胞通常以標(biāo)準(zhǔn)生長模式增殖。 細(xì)胞培養(yǎng)接種后的第一個(gè)生長階段是停滯期，這是細(xì)胞緩慢生長的時(shí)期，此時(shí)細(xì)胞正在適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境并為快速生長做準(zhǔn)備。 停滯期之后是對(duì)數(shù)生長期（即“對(duì)數(shù)"期），這是一個(gè)細(xì)胞呈指數(shù)增殖并消耗培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的時(shí)期。 當(dāng)所有的培養(yǎng)基都被耗盡（即一種或多種營養(yǎng)物質(zhì)已被耗盡）或者當(dāng)細(xì)胞占滿了所有可用的基質(zhì)時(shí)，細(xì)胞就會(huì)進(jìn)入靜止期（即平臺(tái)期），在此階段，細(xì)胞的增殖會(huì)大大減少或停止。 

什么時(shí)候需要進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)？ 

在貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)中，確定是否需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)類似；然而，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和昆蟲細(xì)胞系之間存在一些差異。 

哺乳動(dòng)物細(xì)胞 

細(xì)胞密度：貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞應(yīng)在到達(dá)匯合點(diǎn)之前的對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行傳代。 正常細(xì)胞在到達(dá)匯合點(diǎn)（接觸抑制）時(shí)會(huì)停止生長，而且在重新接種后需要更長的時(shí)間才能恢復(fù)生長。 轉(zhuǎn)化細(xì)胞即使在到達(dá)匯合點(diǎn)后仍能繼續(xù)增殖，但通常在約兩次倍增后會(huì)開始退化。同樣，懸浮細(xì)胞應(yīng)在對(duì)數(shù)生長期，在它們達(dá)到匯合狀態(tài)之前進(jìn)行傳代。 達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)，懸浮細(xì)胞會(huì)聚集成團(tuán)塊，渦旋培養(yǎng)瓶時(shí)，培養(yǎng)基會(huì)變得渾濁。 

培養(yǎng)基耗盡：生長培養(yǎng)基 pH 值下降通常表明乳酸積聚，乳酸是細(xì)胞代謝的副產(chǎn)物。乳酸對(duì)細(xì)胞有毒性，低 pH 值對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境。pH 值的變化速率通常取決于培養(yǎng)物中的細(xì)胞濃度，高細(xì)胞濃度下的細(xì)胞比低細(xì)胞濃度下的細(xì)胞會(huì)更快耗盡培養(yǎng)基。?如果觀察到隨著細(xì)胞濃度的增加，pH 值快速下降（>0.1 – 0.2 pH 單位），則應(yīng)進(jìn)行細(xì)胞傳代。 

昆蟲細(xì)胞 

細(xì)胞密度：昆蟲細(xì)胞應(yīng)在達(dá)到匯合狀態(tài)之前的對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行傳代。 雖然緊密貼壁的昆蟲細(xì)胞可以在匯合狀態(tài)下進(jìn)行傳代，這有助于更容易地從培養(yǎng)容器中分離，但反復(fù)在超過匯合密度的情況下傳代的昆蟲細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出增殖時(shí)間延長、存活率下降以及附著能力減弱的現(xiàn)象。另一方面，如果在昆蟲細(xì)胞達(dá)到匯合狀態(tài)之前進(jìn)行傳代，則需要更大的機(jī)械力才能將它們從單層細(xì)胞中分離出來。當(dāng)反復(fù)在未達(dá)到匯合狀態(tài)之前進(jìn)行傳代時(shí)，這些細(xì)胞也會(huì)表現(xiàn)出增殖時(shí)間延長、存活率下降，并被認(rèn)為處于不健康的狀態(tài)。 

培養(yǎng)基耗盡：通常在比哺乳動(dòng)物細(xì)胞使用的培養(yǎng)基酸性更強(qiáng)的環(huán)境中培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞。 例如，用于培養(yǎng) Sf9 細(xì)胞的 TNM-FH 和 Grace 培養(yǎng)基的 pH 為 6.2。 與哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不同，昆蟲細(xì)胞生長時(shí) pH 值會(huì)逐漸升高，但通常不會(huì)超過 pH 6.4。 然而，與哺乳動(dòng)物細(xì)胞一樣，當(dāng)昆蟲細(xì)胞達(dá)到更高密度時(shí)，生長培養(yǎng)基的 pH 值將開始下降。 

細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)間表 

在進(jìn)行細(xì)胞傳代時(shí)，嚴(yán)格遵守時(shí)間表可以確保細(xì)胞行為的可重復(fù)性，并便于監(jiān)測細(xì)胞的健康狀況。 調(diào)整細(xì)胞接種密度，直到實(shí)現(xiàn)與細(xì)胞類型相匹配的穩(wěn)定生長速率和適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)量。 偏離已建立的生長模式通常表明細(xì)胞培養(yǎng)不健康（例如，退化、污染）或培養(yǎng)系統(tǒng)的某個(gè)組件未正常工作（例如，溫度不適宜、培養(yǎng)基過期）。 我們強(qiáng)烈建議您保持詳細(xì)的細(xì)胞培養(yǎng)記錄，列出補(bǔ)料和傳代的時(shí)間表、使用的培養(yǎng)基類型、采用的解離程序、分瓶比例、形態(tài)學(xué)觀察、接種密度、產(chǎn)量以及任何抗生素的使用情況。 

最好根據(jù)傳代培養(yǎng)時(shí)間表來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和其他非常規(guī)操作（例如，更換培養(yǎng)基類型）。 如果您的實(shí)驗(yàn)時(shí)間表與常規(guī)的傳代培養(yǎng)時(shí)間表不一致，務(wù)必確保不要在細(xì)胞仍處于滯后期或已經(jīng)達(dá)到匯合狀態(tài)并停止生長時(shí)進(jìn)行傳代。 

推薦用于普通細(xì)胞株的培養(yǎng)基 

許多連續(xù)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系可以在相對(duì)簡單的培養(yǎng)基中維持生長，例如添加血清的 MEM，而且在 MEM 中培養(yǎng)的細(xì)胞很可能也可以很容易地在 DMEM 或 Medium 199 中生長。 但是，當(dāng)表達(dá)特異功能時(shí)就可能需要更復(fù)雜的培養(yǎng)基。  有關(guān)針對(duì)給定細(xì)胞類型選擇適當(dāng)培養(yǎng)基的信息通?？稍谝寻l(fā)表的文獻(xiàn)中獲得也可從細(xì)胞來源處或細(xì)胞庫中獲得。 

如果關(guān)于您使用的細(xì)胞類型沒有可用的適當(dāng)培養(yǎng)基信息，可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選擇培養(yǎng)基和血清，或者測試幾種不同的培養(yǎng)基以獲得最佳結(jié)果。 通常，貼壁細(xì)胞培養(yǎng)最好從 MEM 培養(yǎng)基開始，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)最好從 RPMI-1640 培養(yǎng)基開始 

通常在比哺乳動(dòng)物細(xì)胞使用的培養(yǎng)基酸性更強(qiáng)的環(huán)境中培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞，如 TNM-FH 和 Grace 培養(yǎng)基。 

貼壁細(xì)胞解離 

貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)的第一步是通過酶解或機(jī)械方法將細(xì)胞從培養(yǎng)容器的表面分離下來。 下表列出了各種細(xì)胞解離程序。 

TrypLE 解離酶 

Gibco TrypLE Express 和 TrypLE Select 是微生物生產(chǎn)的細(xì)胞解離酶，其動(dòng)力學(xué)和切割特異性與胰蛋白酶相似。 盡管 GIBCO ™ TrypLE ™ 酶可在解離過程中直接替代胰蛋白酶，無需更改方案，但我們建議您首先優(yōu)化解離的孵育時(shí)間。 由于 TrypLE 酶是重組真菌胰蛋白酶樣蛋白酶，因此非常適合需要非動(dòng)物源性試劑的應(yīng)用。 下表將 TrypLE Express 和 TrypLE Select 與胰蛋白酶進(jìn)行了比較。 

貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)方案及步驟 

貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)是細(xì)胞在附著于促生長基質(zhì)時(shí)能夠增殖，這種特性被稱為 “錨定依賴性"。以下方案詳細(xì)介紹了從培養(yǎng)器皿中解離貼壁細(xì)胞以及后續(xù)傳代（或分瓶）貼壁細(xì)胞的各種方法。 

用于分離和傳代貼壁細(xì)胞的材料 

除以下目錄產(chǎn)品外，分離和傳代貼壁細(xì)胞還需要： 

· 貼壁細(xì)胞 

· 經(jīng)組織培養(yǎng)處理的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿 

· 生長培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清和補(bǔ)充劑，預(yù)熱至 37°C 

· 一次性無菌 15 mL 試管 

· 37°C 培養(yǎng)箱，含 5% CO?的 humidified atmosphere 

· 移液管和移液管吸頭 

· 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器，如 Countess 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器 

貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)步驟 

以下貼壁細(xì)胞培養(yǎng)步驟描述了哺乳動(dòng)物細(xì)胞的傳代方法。請(qǐng)注意，昆蟲細(xì)胞的傳代步驟與哺乳動(dòng)物細(xì)胞在多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)存在差異。如需了解更多信息，請(qǐng)參考《貼壁昆蟲細(xì)胞傳代培養(yǎng)注意事項(xiàng)》。 

在實(shí)驗(yàn)中對(duì)特定細(xì)胞系進(jìn)行傳代時(shí)，建議嚴(yán)格遵循所用產(chǎn)品的說明書，尤其是關(guān)于培養(yǎng)基的配制要求。偏離特定細(xì)胞類型指定培養(yǎng)條件的后果可能從異常表型的表達(dá)，到細(xì)胞培養(yǎng)的失敗不等。賽默飛世爾科技所有產(chǎn)品的安全數(shù)據(jù)表（SDS）可在此處查閱。 

傳代前，確保與細(xì)胞接觸的溶液和設(shè)備均無菌。在整個(gè)傳代過程中使用正確的無菌操作，并在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行操作。 

傳代前需常規(guī)監(jiān)測細(xì)胞活力。貼壁細(xì)胞應(yīng)在對(duì)數(shù)生長期傳代，此時(shí)細(xì)胞活力需大于 90%。 
 

1. 從培養(yǎng)容器中移除并丟棄用過的細(xì)胞培養(yǎng)液。 

2. 使用不含鈣和鎂的平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞（每 10 cm2 培養(yǎng)表面積約 2 mL）。將洗滌液輕輕加入容器中與貼壁細(xì)胞層相對(duì)的一側(cè)，避免干擾細(xì)胞層，然后前后搖晃容器數(shù)次。洗滌步驟可去除可能抑制解離試劑作用的血清、鈣和鎂殘留。 

3. 從培養(yǎng)容器中移除并丟棄洗滌液。 

4. 向培養(yǎng)瓶側(cè)壁加入預(yù)熱的解離試劑（如胰蛋白酶或 TrypLE），用量以覆蓋細(xì)胞層為宜（每 10 cm2 約 0.5 mL）。輕輕搖晃容器，確保細(xì)胞層被試劑覆蓋。 

5. 將培養(yǎng)容器在室溫下孵育約 2 分鐘。注意，實(shí)際孵育時(shí)間因細(xì)胞系而異。 

6. 在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否脫落。如果脫落的細(xì)胞不足 90%，可延長孵育時(shí)間幾分鐘，每 30 秒檢查一次解離情況。也可輕敲容器以加速細(xì)胞脫落。 

7. 當(dāng)≥90% 的細(xì)胞脫落時(shí)，短暫傾斜容器讓細(xì)胞聚集。加入 2 倍體積（相對(duì)于解離試劑用量）的預(yù)熱培養(yǎng)基，通過吸管在細(xì)胞層表面反復(fù)吹吸以分散細(xì)胞。 

8. 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 15 mL 離心管，以 200×g 離心 5-10 分鐘。注意，離心速度和時(shí)間因細(xì)胞類型而異。 

9. 用少量預(yù)熱的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，并取樣計(jì)數(shù)。 

10. 使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板結(jié)合臺(tái)盼藍(lán)排斥法，或 Invitrogen Countess 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定總細(xì)胞數(shù)和存活率。如有必要，向細(xì)胞中添加培養(yǎng)基以達(dá)到所需濃度，并重新計(jì)數(shù)。 

11. 將細(xì)胞懸液稀釋至該細(xì)胞系推薦的接種密度，將適當(dāng)體積的細(xì)胞懸液移入新的培養(yǎng)容器，放回培養(yǎng)箱。如果使用培養(yǎng)瓶，除非是帶有透氣蓋的通氣培養(yǎng)瓶，否則需松開瓶蓋以保證氣體交換。 

貼壁昆蟲細(xì)胞傳代培養(yǎng)注意事項(xiàng) 

雖然昆蟲細(xì)胞傳代的一般步驟與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相同，但這兩種培養(yǎng)體系的一些關(guān)鍵要求存在差異。為獲得最佳結(jié)果，請(qǐng)始終遵循實(shí)驗(yàn)中所用產(chǎn)品的說明書。 

貼壁昆蟲細(xì)胞的傳代時(shí)機(jī) 

昆蟲細(xì)胞應(yīng)在對(duì)數(shù)生長期、未達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)傳代，除非是強(qiáng)貼壁性細(xì)胞。對(duì)于強(qiáng)貼壁性昆蟲細(xì)胞，可在達(dá)到匯合狀態(tài)或剛開始從培養(yǎng)瓶底部脫離時(shí)傳代，此時(shí)細(xì)胞更易脫落。然而，若昆蟲細(xì)胞反復(fù)在超過匯合密度時(shí)傳代，會(huì)出現(xiàn)倍增時(shí)間延長、存活率下降和貼壁能力減弱的情況。 

相反，在貼壁培養(yǎng)中，若昆蟲細(xì)胞在未達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)傳代，需要更大的機(jī)械力才能使其從單層上脫落。若反復(fù)在未匯合時(shí)傳代，細(xì)胞也會(huì)出現(xiàn)倍增時(shí)間延長、存活率下降的不健康狀態(tài)。匯合度低于 20% 同樣會(huì)抑制細(xì)胞生長。 

昆蟲細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法 

· 昆蟲細(xì)胞需在 27°C、非 humidified 環(huán)境中培養(yǎng)。細(xì)胞可在室溫下避光放置于桌面或抽屜中，但建議使用 27°C 的恒溫環(huán)境。 

· 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)不建議進(jìn)行 CO?交換。 

· 使用專為昆蟲細(xì)胞生長配制的培養(yǎng)基。昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基通常比哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基更偏酸性（如 Grace 培養(yǎng)基）。如需了解更多關(guān)于昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基的信息，請(qǐng)?jiān)L問 “細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境"。 

· 在無血清條件下，昆蟲細(xì)胞與基質(zhì)的貼附非常緊密，需要額外操作才能使其脫落。可通過快速抖動(dòng)手腕搖晃培養(yǎng)瓶來輔助脫落。為避免污染，操作前需擰緊瓶蓋。 

· 切勿劇烈搖晃培養(yǎng)瓶，否則可能損傷細(xì)胞。 

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