質粒轉染 返回列表頁

1）技術原理:

轉染類型：根據不同的實驗目的，外源DNA導入哺乳動物細胞又可分為瞬時轉染和穩(wěn)定轉染。

瞬時轉染一般是指外源基因進入受體細胞后，存在于游離的載體上，不整合到染色體，在外源DNA導入細胞1—4天后收獲轉染細胞對轉染基因的轉錄和復制進行分析。

而穩(wěn)定轉染則需要使外源基因整合于細胞染色體從而得到穩(wěn)定的轉染細胞株。實現細胞的穩(wěn)定轉染，通常需要一個抗生素篩選的過程。

除DEAE葡聚糖只能用于瞬時轉染，其他方法均可用于瞬時轉染和穩(wěn)定轉染。

質粒轉染是指將外源分子如DNA，RNA等導入真核細胞的技術。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發(fā)展，轉染已經成為研究和控制真核細胞基因功能的常規(guī)工具。在研究基因功能、調控基因表達、突變分析和蛋白質生產等生物學試驗中，其應用越來越廣泛。

因為不同的細胞在生理代謝及分裂上均存在差異，因此研究者將外源遺傳物質導入細胞的過程中需要選擇不同的方式。目前，將外源物質導入細胞的方法主要分為三大類：1、脂質體（或是脂質體替代物）轉染；2、電轉；3、病毒感染。這三種方法互有優(yōu)劣。脂質體或是脂質體替代物轉染操作簡便，價格低廉，但是對細胞毒性大。而且，有些細胞通過脂質體轉染效率很低；電轉操作方便快捷，但是需要專門的儀器，對細胞損傷也比較大；病毒感染克服了前兩者的劣勢，感染效率高，對細胞毒性小，但是病毒前期包裝需要大量的時間和精力 。

備注：不含細胞株、轉染試劑。

2）質粒轉染的詳細介紹

脂質體：中性脂質(lipid)是利用脂質膜包裹DNA，借助脂質膜將DNA導入細胞膜內。帶正電陽離子脂質體(Cationic liposomes)則不同，DNA并沒有預先包埋在脂質體中，而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質體上，形成DNA-陽離子脂質體復合物，據認為一個約5kb的質粒會結合2-4個陽離子脂質體，從而吸附到帶負電的細胞膜表面，經過內吞被導入培養(yǎng)的細胞。脂質體轉染方法始于1987年，這個方法的出現使得轉染效率、轉染的穩(wěn)定性和可重復性大大提高，并廣為使用。陽離子脂質體細胞毒性相對較高，對不同的細胞可能會干擾細胞的代謝。血清的存在有可能會影響轉染效率，需要進行優(yōu)化。通常轉染試劑有不同脂質（lipid）和脂質體（liposome）混合配方。

非脂質體的脂質（Non-liposomal lipids）：這個讀著頗為拗口的新一代技術，代表著脂質體技術的未來發(fā)展方向——革新配方成分形成膠束（micellar）結構而非簡單的雙層膜結構，令核酸傳遞更有效率而且細胞毒性也顯著降低

活化的樹狀聚合物（Activated dendrimers）：這個確乎是Qiagen的獨門配方的Activated dendrimers本來真正屬于納米技術，高度樹狀分枝形成球形結構有著均一的大小和形狀，借助每個球體無數活化的氨基末端凝聚在DNA上形成較為致密的結構，并吸附在細胞膜上，經過內吞進入細胞。活化的氨基可以調節(jié)胞內融酶體的pH值，抑制降解活性，使得DNA穩(wěn)定存在。轉染的效率高，毒性低，可重復性好。血清的存在能顯著提高轉染效率。

多胺和新一代轉染介質：多胺其實也是氨基多聚物，原理無非基于吸附帶負電的核酸形成非共價結合的復合物，結合并穿越同樣帶負電的細胞膜。優(yōu)點是可以攜帶較大的分子，而且細胞毒性也較低，不會干擾細胞代謝途徑。新一代轉染介質并不局限于單一成分，各種不同配方的脂質、加上蛋白質組分、以及各種各樣的成分，務求令轉染效率更高，操作更方便，細胞毒性更低。還有的產品將脂質偶聯到細胞膜特定受體蛋白的配基上，讓受體蛋白更有效率地轉運DNA或者生物大分子復合物進入細胞……

顯微注射和基因槍（Biolistic particle delivery）：顯微注射和基因槍是更特殊的導入DNA的方式：將DNA沉淀包被在極為微小的金顆粒（閃閃發(fā)光的金珠，gold beads）上，借助高壓基因槍將大分子直接“射"入細胞，一旦細胞接受，就會發(fā)生瞬時表達——這種方法多用于活體內導入DNA，比如皮膚的DNA免疫。也有用于上皮細胞原代細胞的報告。是利用硅納米顆粒作為基因轉染載體。
顯微注射顧名思義就是使用一根超細針頭將DNA，RNA或蛋白直接注入細胞質或細胞核；整合的機會高一些，但適用這種方法的細胞好像不多，體外受精較為常見。這兩種方法需要的昂貴設備和相對復雜的技術，令普通實驗室敬而遠之。