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NADP 磷酸酶（NADPase）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

NADP 磷酸酶試劑盒 輔酶Ⅱ

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

NADPase 主要存在于植物組織中，是生物體內(nèi)唯yi催化 NADP+降解為NAD+的酶，與 NADK 一起調(diào)控NAD 和NADP 之間的平衡。

測定原理：

NADPase 能夠催化NADP+水解為NAD+和無機(jī)磷的反應(yīng)，通過測定無機(jī)磷的量來測定NADPase 活性。

組成：

試劑二：粉劑×5 支，-20℃保存；用時每支加入 1 ml 試劑一充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時加入 25ml 蒸餾水，溶解后 4℃可保存一周。試劑四：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時加入 25ml 蒸餾水，溶解后 4℃可保存一周。試劑六：10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10ml×1 瓶，4℃保存。

0.5μmol/ml 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將試劑六 20 倍稀釋，即取 0.5ml 試劑六加 9.5 蒸餾水，充分混勻。

定磷試劑的配制：按 H2O: 試劑三:試劑四:試劑五=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色，若無色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

自備儀器和用品：

可見分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水

樣本的前處理：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、酶促反應(yīng)

37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）預(yù)熱 5min

37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）準(zhǔn)確反應(yīng) 30min 后，95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻后，10000g 25℃離心 5min，取上清

2、定磷

混勻，37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 30min，冷卻至室溫，在 660nm 處，蒸餾水調(diào)零，記錄各管吸光值。

注意事項(xiàng)：

1、此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對測定所用試管要求嚴(yán)格，要沒有一點(diǎn)磷，若試管放過磷酸 或磷酸鹽緩沖液，一定要洗得非常干凈，要先用洗潔精加水煮，再用自來水沖，最后用蒸餾水沖干凈。最好用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是檢測成敗的關(guān)鍵。

2、標(biāo)準(zhǔn)管、空白管和對照管只要做一次即可。

NADPase 酶活性計算：

1、按組織蛋白濃度計算：

定義：每小時每毫克組織蛋白NADPase 分解NADP 產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個 NADPase 活力單位。

NADPase (μmol/h/mg prot)=(C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總)×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷ (V 樣×Cpr)÷T=5×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷Cpr

2、按樣本鮮重計算：

定義：每小時每g 組織NADPase 分解NADP 產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個 NADPase 活力單位。

NADPase (μmol/h/g 鮮重)=(C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總)×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）× V 總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=5×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/ml；V 總：酶促反應(yīng)總體積，0.5ml；V 樣：加入樣本體積，0.1ml ；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時間，0.5 小時；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本鮮重，g。

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