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果糖-6-磷酸激酶（6-phosphofructokinase，PFK）試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

果糖-6-磷酸激酶試劑盒 糖酵解

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

PFK（EC 2.7.1.11）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，負責將果糖-6-磷酸和ATP 轉(zhuǎn)化為果糖-1,6 二磷酸和ADP，是糖酵解過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶之一。

測定原理：

PFK 催化果糖-6-磷酸和ATP 生成果糖-1,6-二磷酸和ADP，丙tong酸激酶和乳酸脫氫酶進一步依次催化 NADH 氧化生成NAD⁺，在 340nm 下測定NADH 下降速率，即可反映PFK 活性。

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（ml）為 1000~5000：1 的比例（建議 2000 萬細菌或細胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

在試劑二瓶中加入 17ml 試劑一和 1.13ml 蒸餾水充分溶解，置于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

在試劑三中加入 1ml 蒸餾水充分混勻，冰上放置備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

在試劑四中加入 1ml 蒸餾水充分混勻，冰上放置待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本、10μl 試劑三、10μl 試劑四和 170μl 試劑二，混勻，立即記錄 340nm 處 20s 時的吸光值A(chǔ)1 和 10min20s 后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A1-A2。

注意：不同勻漿組織中 PFK 活力不一樣，做正式試驗之前請做 1-2 只預(yù)試，若ΔA>0.5，則說明活力太高，必須用提取液稀釋成適當濃度勻漿上清液（計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），或縮短反應(yīng)時間至 2min 或 5min,使ΔA<0.5，以提高檢測靈敏度。

PFK 活力單位的計算：

用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

1、血清（漿）PFK 活力的計算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=321×ΔA 2、組織、細菌或細胞中 PFK 活力計算：

按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP 定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=321×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=321×ΔA÷W

按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(2000×V 樣÷V 樣總)÷T=0.1605×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細菌或細胞總數(shù)，2000 萬。

用 96 孔板測定的計算公式如下：

1、血清（漿）PFK 活力的計算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=642×ΔA 2、組織、細菌或細胞中 PFK 活力計算：

按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和

1nmol ADP 定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=642×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=642×ΔA÷W

按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(2000×V 樣÷V 樣總)÷T=0.321×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細菌或細胞總數(shù)，2000 萬。

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